第12章 DNA生物合成

1DNA的生物合成第十二章DNABiosynthesis，Replication2内容第二节DNA复制的酶学和拓扑学变化第三节DNA生物合成过程第一节复制的基本规律

第四节逆转录和其他复制方式第五节DNA损伤（突变）与修复1.DNA复制

2.DNA损伤修复DNA生物合成RNA生物合成蛋白质生物合成3.逆转录4

指遗传物质的传代。以亲代DNA为模板，dNTP(dATPdGTPdCTPdTTP)为原料，按照碱基配对的规律合成子代DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA复制(replication)5复制的基本规律BasicRulesofDNAReplication

第一节6半保留复制(semi-conservativereplication)复制的高保真性(highfidelity)

双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)

复制的特点7一、半保留复制DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念复制在理论上可能的几种方式密度梯度实验DNA半保留复制模型11按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。12原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。

二、双向复制复制中的放射自显影图象13真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)

。复制子是独立完成复制的功能单位。14顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。另一股链复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。

三、复制的半不连续性15DNA复制的酶学和拓扑学变化TheEnzymologyofDNAReplication第二节16参与DNA复制的物质底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol模板(template):

解开成单链的DNA母链引物(primer):

提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白质因子17DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5

3

方向进行。一、复制的化学反应(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

18二、DNA聚合酶

以dNTP作为底物催化DNA合成的一类酶，需要DNA作为模板，故全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)，简称：DNA-pol特征：不能从游离的核苷酸开始合成DNA链，这个聚合反应需要引物，活性：1.5

3

的聚合活性

2.核酸外切酶活性191.原核生物的DNA聚合酶3

5

外切酶活性:能辨认错配的碱基对，并将其水解,即时校读。

5

3

外切酶活性:能切除突变的DNA片段。去除起始DNA合成所需的引物。

核酸外切酶活性323个氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸5

DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端DNA-polⅠ木瓜蛋白酶Klenow片段Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

C端功能:是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢDNA-polⅢ同时合成领头链和随从链242.真核生物的DNA聚合酶25三、复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和即时校读

（二）复制的保真性和碱基选择26A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。271.遵守严格的碱基配对规律2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能DNA复制的保真性至少要依赖三种机制

28四、复制中的解链及DNA分子拓扑学变化

DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

29解螺旋酶(helicase)—利用ATP供能，作用于氢键使DNA双链解开成为两条单链引物酶(primase)—复制起始时催化生成RNA引物的酶单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)—在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整

108

局部解链后DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)

解链过程中正超螺旋的形成目录32拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键

拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ分类33拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制34五、DNA连接酶连接DNA链3

-OH末端和相邻DNA链5

-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。PHO5’DNA连接酶3’3’5’5’3’3’5’ATPADP35DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。连接酶功能36DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication第三节371.复制的起始:•解链及复制叉的形成•引发体的形成—引物的合成2.链的延伸:•领头链和冈崎片的形成•随从链3.链的终止

•

引物的切除和缺口的填补•随从链DNA片段的连接一、原核生物的DNA生物合成38E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···

1

13

17

29

32

44

···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串联重复序列

反向重复序列5

3

5

3

（一）复制的起始DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3

5

3

5

引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。

引物3'HO5'引物酶引物41（二）复制的延长在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物上或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

方向：子链合成的方向为5’3’特点：半不连续复制科学出版社案例式教材《生物化学》课件42DNA聚合酶Ⅲ拓扑酶SSB解螺旋酶引物酶引物冈崎片段领头链随从链43原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriter

E.coli8232oriterSV40500（三）复制的终止5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATPADP+Pi5

5

DNA连接酶切除引物、填补空隙、连接缺口复制过程动画46哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成

•

细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。•

蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。47•多个起始点，双方向复制，是多复制子。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。•复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。•增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。（一）复制的起始483

5

5

3

领头链3

5

3

5

亲代DNA随从链引物核小体（二）复制的延长49染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。是否会出现下列缩短情况？末端复制与端粒酶（三）复制的终止和端粒酶50端粒(telomere)指真核生物染色体线性DNA分子末端结构功能•

维持染色体的稳定性•

维持DNA复制的完整性结构特点•

由末端单链DNA序列和蛋白质构成。•

末端DNA序列是多次重复的富含T、G碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…51端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

组成：作用：填补子链5’-末端引物水解后留下的空隙，防止DNA缩短。端粒酶催化作用的爬行模型科学出版社案例式教材《生物化学》课件53端粒酶脱氧核苷酸端粒酶RNA54逆转录和其他复制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays第四节55RNADNA

逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶

逆转录：(reversetranscription)

以病毒RNA作模板，dNTP为底