茯砖茶中冠突散囊菌检测方法的改进

茯砖茶中冠突散囊菌检测方法的改进

福砖茶是中国特有的边茶。它是边境地区人民预防疾病的主要药物，也是人们生活中维生素和养分的重要来源，因此它引起了人们的注意[1.2]。成品茯砖茶表面存在一种俗称“金花”的金黄色小点。研究表明,该“金花”是冠突散囊菌的闭囊壳堆,其多少决定了茯砖茶的品质,多者为佳,因此冠突散囊菌在茯砖茶中的含量已成为了茯砖茶品质评判的主要指标。目前国家标准《GB/T9833.3-2002紧压茶茯砖茶》规定每克茯砖茶干茶中冠突散囊菌菌数不小于3.0×105。茯砖茶中的主要菌群是散囊菌属和一些霉菌,因此除了冠突散囊菌以外还存在着大量的形态与之相似的散囊菌,如间型散囊菌、谢瓦散囊菌、阿姆斯特丹散囊菌、栖土曲霉和蜡叶散囊菌等[4，5],这些菌的存在严重影响了冠突散囊菌的准确检测。本研究通过形态学方法对茯砖茶中的常见散囊菌和曲霉进行对比研究,使茯砖茶中的冠突散囊菌与一些常见的其他霉菌可进行区分,以期为茯砖茶中冠突散囊菌检测方法的改进提供依据。1材料和方法1.1微生物菌种的保鲜冠突散囊菌(Eurotiumcristatum,CGMCC3.0462)、间型散囊菌(Eurotiumintermedium,CGMCC3.4318)、谢瓦散囊菌(Eurotiumchevalieri,CGMCC3.6492)、阿姆斯特丹散囊菌Eurotiumams-telodami,CGMCC3.6518)、栖土曲霉(Aspergillusterri-cola,CGMCC3.3557)、蜡叶散囊菌(Eurotiumherbari-oum,CGMCC3.6496),购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,福建省产品质量检验研究院食品所微生物实验室保藏。1.2主试剂和设备1.2.1nano33.0马铃薯培养基(PDA)(g/L):马铃薯200,葡萄糖20,琼脂20,pH自然。察氏培养基(g/L)[6，7]:NaNO33.0,K2HPO41.0,KCl0.5,MgSO4.7H2O0.5,FeSO4.7H2O0.01,蔗糖30,琼脂20,pH自然。20%蔗糖察氏培养基(g/L):NaNO33.0,K2HPO41.0,KCl0.5,MgSO4.7H2O0.5,FeSO4.7H2O0.01,蔗糖200,琼脂20,pH自然。1.2.2日本生物安全柜型LRH生化培养箱(上海一恒科技有限公司),BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜(苏净集团安泰公司),YS100型光学显微镜(日本尼康株式会社)。1.3实验方法1.3.1d活化试验取保藏于4℃冰箱中的斜面菌种,用接种环刮取一环菌种接种到PDA斜面上,28℃培养7d进行活化。用无菌生理盐水洗下活化后的斜面,制备成菌悬液(孢子悬液),然后用接种针分别蘸取各菌种菌悬液(孢子悬液)点种于PDA平板、察氏平板和20%蔗糖察氏平板上,28℃培养14d。1.3.2关于群落形态和显微结构的观察培养过程观察菌落形态变化,并挑取菌体进行制片观察[7~9]。2养基对受试菌菌体形态的影响实验通过跟踪茯砖茶中常见的不同散囊菌和曲霉在PDA培养基、察氏培养基和20%蔗糖察氏培养基上的生长情况,考察不同培养基对受试菌的菌落形态和菌体形态的影响。结果表明,所有受试菌株在各种培养基上前1d~2d菌落、菌丝均为白色,无特征形态结构出现,3d后菌落菌体开始出现各种形态变化,5d后各菌的形态结构都趋于稳定,且不同散囊菌和曲霉在不同培养基上培养会发生不同程度的形态变化。根据文献和,选择培养至第14d的菌落形态和显微图像进行分析,结果见图1,图2和图3。2.1显微结构及生长特点冠突散囊菌在PDA上的生长速度为78mm/14d,菌落成绒状,圆形,中间菌体较高,正面为草绿色,背面为灰白色,无脊无褶;菌丝有足细胞,分生孢子梗的末端膨大形成球状的顶囊,分生孢子呈球形,绿色,成串生长。阿姆斯特丹散囊菌在PDA上的生长速度为55mm/14d,菌落呈絮状,菌丝稀疏,边沿不整齐,菌落为浅绿色,背部形态与显微结构均与冠突散囊菌相似。蜡叶散囊菌在PDA上的生长速度为73mm/14d,菌落为扁平绒状,边沿不整齐,菌落为黄色,菌落背面黄色、中心部位颜色较深,光滑无脊;菌丝有隔,有足细胞,分生孢子梗的为棒状,较短,分生孢子呈球形或椭圆形,成串生长,数量不多。栖土曲霉在PDA上的生长速度为43mm/14d,菌落形态颜色和菌体显微结构与冠突散囊菌均相似,不过其菌落边沿易散落生长小菌落且菌体生长速度较慢。谢瓦散囊菌在PDA上的生长速度为86mm/14d,菌落正面为浅绿色绒毛状,边沿整齐,背面也为灰白色,无脊;其显微结构与冠突散囊菌有较大的差别,球形顶囊较冠突散囊菌小,成串生长的球形孢子数量极多,分生孢子头呈拖把头状。间型散囊菌在PDA上的生长速度为46mm/14d,菌落正面反与冠突散囊菌相似;有倒置烧瓶状分生孢子头,孢子呈球形。所有受试菌在PDA上培养均无闭囊壳产生。2.2生长和形态特征由实验结果可知,冠突散囊菌在察氏培养基上生长速度为90mm/14d,菌落为绒状,平整,菌体密度高于PDA,菌落中间部分为黄色,有大量的金黄色闭囊壳,菌落外圈为绿色,夹带些许黄色闭囊壳,菌落背面为黄褐色、边沿有分布有3~5mm长的放射状脊,有球型分生孢子头。阿姆斯特丹散囊菌在察氏培养基上生长速度为63mm/14d,菌落形态与冠突散囊菌几乎一样,不过其中间部位黄色闭囊壳含量较低,菌落背面黄褐色颜色更深,背面分布有大量10~15mm长放射状脊。蜡叶散囊菌在察氏培养基上生长速度为41mm/14d,菌落密实,绒状,表面多褶皱呈鱼鳞状,边沿整齐,菌落正面都为蛋黄色,有大量的黄色闭囊壳,无分生孢子头,菌落背面为黄褐色,中心部位颜色较深。栖土曲霉在察氏培养基上生长速度为75mm/14d,菌落正反面形态与阿姆斯特丹散囊菌相似,不同之处在于其中心部位亦有短小的褶,边沿分布的放射状脊长度在5-10mm间,且分布均匀。谢瓦散囊菌在察氏培养基上生长速度为80mm/14d,菌落为褐色绒毛状,边沿整齐,菌落背面为褐色,菌落颜色较其它受试菌相对于PDA发生了非常显著的变化,同时其有10-30mm长的放射状脊。间型散囊菌与冠突散囊菌的生长情况基本一样,不过其分生孢子头由原来在PDA的球形变成拖把头样。2.3菌落形态和形态冠突在20%蔗糖察氏培养基上,其生长速度为85mm/14d,菌落毛绒状,中间高、边沿低,正面整体呈黄色,中心部位较边沿更黄,有大量的金黄色闭囊壳分布,菌落背面为黄色,无脊光滑,有分生孢子头。阿姆斯特丹散囊菌在20%蔗糖察氏培养基上,其生长速度为76mm/14d,菌落菌体形态与冠突散囊菌相近,不同在于其中心部位有5~15mm长放射状脊。蜡叶散囊菌在20%蔗糖察氏培养基上,其生长速度为86mm/14d,菌落绒状,扁平,菌落正面为黄绿色,中心部位为黄色、边缘有斑驳的绿色,有少量的黄色闭囊壳分布,有部分分生孢子头,菌落背面为黄褐色,中心部位和边沿颜色较深,无脊。栖土曲霉在20%蔗糖察氏培养基上的生长速度为83mm/14d,菌落菌体形态与冠突散囊菌相似。差异在于其中心部位有3-10mm长的曲折状脊。谢瓦散囊菌在20%蔗糖察氏培养基上生长速度为84mm/14d,菌落为黄绿色绒毛状,颜色较冠突散囊菌浅,中心部位有白色丝状菌丝,有分生孢子头,孢子成串生长,菌落背面为灰白色,无脊。间型散囊菌在20%蔗糖察氏培养基上生长速度为88mm/14d,菌落形与冠突散囊菌相似,不过分生孢子串较在察氏培养基上变短。3散囊菌的形态不同散囊菌和曲霉在不同培养基上培养会发生不同程度的形态变化。在所试的6株菌在PDA培养基上都为无性生殖,菌落背部皆为光滑无脊,菌落颜色除了蜡叶散囊菌为黄色外其他菌株都为绿色,而且所有菌种生长状况都没有察氏培养基和20蔗糖察氏培养基好。在察氏培养基上,不同测试菌株的菌体形态相对于在PDA上生长时发生了明显的分化,除蜡叶散囊菌有亮黄色变为淡黄色和谢瓦散囊菌由浅绿色变为褐色外,其他菌落颜色都由绿色转变为黄绿色,不过颜色变化程度各不相同;菌体普遍有无性繁殖向有性繁殖转变,特别是蜡叶散囊菌在察氏培养基上均为有性繁殖,未发现无性生殖器官;菌落背部颜色和形态也都发生了明显转变,背部颜色都变为黄褐色,也都出现了放射状的褶脊,不过不同菌株的背部颜色和褶脊的形态各有差异,这可以应用于茯砖茶中散囊菌的鉴别。在20%蔗糖察氏培养基上,冠突散囊菌、阿姆斯特丹散囊菌和栖土曲霉菌落颜色均由察氏培养基上的黄绿色向金黄色转变,黄色闭囊壳的量也都变多,同时菌落背面的颜色和形态也都发生了不尽相同的变化,如冠突散囊菌和栖土曲霉菌落背面颜色由黄褐色变为黄色、有脊变为无脊,阿姆斯特丹散囊菌背面颜色由黄褐色变为黄色、原本分布在菌落边沿的放射状脊变成出现在菌落中心位置;蜡叶散囊菌菌落颜色由蛋黄色变成黄绿色,菌落表面由褶皱变成平整,出现分生孢子头,菌落背面由有褶变