第六章 农业微生物常用技术

农业微生物常用技术主要内容微生物的基本概念和特点微生物在生物界的地位农业微生物学研究常用技术微生物的基本概念一、微生物的发现

1676年，荷兰，列文虎克，单式显微镜（复制品）微生物的基本概念一、微生物的发现A、C、F、G：杆菌E：球菌H：球菌的聚集体列文虎克向英国皇家学会的信中对细菌形态的描绘

微生物的基本概念二、微生物的定义细小的肉眼看不见的生物称微生物。非细胞生物原核生物部分真核生物（真菌、藻类、原生动物）微生物一、体积小，比表面积大单位：um(10-6m)或nm(10-9m)2μm0.5μm杆菌80个杆菌肩并肩总宽度=1根头发丝的宽度1500个杆菌首尾相连总长度=1粒芝麻的长度微生物的体积大小微生物的特点不同生物类型细胞大小的比较微生物的特点一、体积小，比表面积大微生物与其它生物种类的体积比较动物的模式细胞动物细胞核细菌病毒动物、植物和微生物个体大小尺度范围

二、吸收多，转化快人（50kg）500~1000g/d地鼠（体重3g）3g/d大肠杆菌细胞重量2000倍糖/h奶牛（500kg）合成0.5kg蛋白质/24h微生物细胞合成自身重量30-40倍的细胞物质/24h吸收多转化快微生物的特点三、生长旺，繁殖速大肠杆菌在合适的生长条件下：12.5~20分钟繁殖1代每小时分裂3代，由1个变成8个。经24小时分裂72代，重约4722吨经48小时可产生2.2×1043个后代。微生物的特点地球重的4000倍微生物代时及每日增殖率微生物名称代时(分)温度日增殖率乳酸菌38252.7×10^11大肠杆菌18371.2×10^24根瘤菌110258.2×10^3枯草杆菌31307.2×10^13光合细菌144301.0×10^3酿酒酵母120304.1×10^3念珠藻1380252.1硅藻1020202.64小球藻4202510.6草履虫642264.92

四、适应性强，易变异1、对营养物质的利用上的适应性。2、对环境条件尤其是恶劣的“极端环境”的适应性。

耐0～-196℃低温耐250℃～300℃的高温耐盐（饱和盐水）耐干燥（产芽孢细菌、真菌孢子）耐酸碱、耐缺氧、耐毒物、抗辐射适应性强微生物的特点四、适应性强，易变异易变异青霉素生产菌的发酵水平1940年每毫升20单位2000年每毫升10万单位青霉素的使用剂量：1940年10万元单位/次1980年：输液80万单位/次2000年：输液800万-1000万单位/次微生物的特点青霉素对金黄色葡萄球菌最低抑制浓度0.02μg/ml200μg/ml五、分布广，种类多微生物在自然界的分布：无处不在，无孔不入分布广土壤空气水域生物体内外极端环境正常环境高空深海底2000米深的地层温泉微生物的特点五、分布广，种类多60年前，中国人乘飞机采集了160米到5300米的高空的气样并分析了其中的微生物发布状况。微生物的特点五、分布广，种类多种类多地球上的微生物：估计有100万种以上已发现的微生物：约有10万种已开发利用的微生物：约1000种

微生物的特点微生物的微观性研究手段的限制分离培养的局限微生物在生物界的地位无细胞结构生物—病毒具细胞结构生物生物原核生物真核生物真细菌古细菌真菌藻类原生动物动物植物真细菌真菌藻类原生动物动物植物真核生物古细菌生物沃氏提出的三域（三原界）分类系统农业微生物常用技术传统的微生物分离培养；农药残留微生物降解技术；微生物分子生态学。微生物农药；传统的微生物分离培养传统的微生物分离培养传统的微生物分离培养传统的微生物分离培养传统的微生物分离培养微生物的分类和鉴定细菌的分类和鉴定：1、菌株形态学特征；2、菌株的生理生化特性；3、菌株的化学分类特性；4、菌株的基因型分析。微生物的分类和鉴定细菌菌株形态学特征：1.1菌落形态的观察：纯化得到单菌落后，观察菌落颜色、菌落形状、菌落大小、菌落中心隆起情况、菌落表面形态、菌落边缘整齐程度、菌落透明度、菌落湿润程度以及是否产生色素。

1.2菌体形态大小的观察：对处于对数生长期的细菌菌株进行革兰氏染色，并观察菌体的形态，用镜台微尺测菌体的长和宽，同时拍摄显微照片。细菌的形态和结构观察在显微镜下观察细菌个体的形态细菌形态受培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。微生物的分类和鉴定菌株的生理生化特性：2.1生长曲线测定；2.2C源利用实验；2.3N源利用实验；2.4产酸产气实验；------BIOLOG碳源自动分析鉴定；API鉴定分类系统。微生物的分类和鉴定菌株的化学分类特性：3.1细胞壁氨基酸和肽聚糖的分析；3.2细胞壁水解物的单糖分析；3.3脂肪酸组成分析；3.4细胞磷脂分析。微生物的分类和鉴定菌株的基因型分析：1、16SrDNA序列分析；2、G+C%含量分析。定义菌种保藏是指在广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不污染以便于研究、交换和使用的目的。

微生物菌种的保藏

菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。一种好的保藏方法，首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变。菌种保藏的原理菌种保藏在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本要求：基本方法：生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥农业微生物常用技术传统的微生物分离培养；农药残留微生物降解技术；微生物分子生态学。微生物农药；农药残留微生物降解技术一、技术背景与原理二、技术成果三、技术前景目录农药残留微生物降解技术你还想吃吗…如果你知道它含有10种农药残留在过去、现在和将来，农药都在农业生产上发挥重大的作用，但是农药的不科学使用导致水体、土壤和大气中农药残留超标，严重危害自然环境和人类健康。技术背景与原理农药残留微生物降解技术我国年农药使用量在30万吨（原药）以上，而农药的利用率只有20-30%，其余残留进入生态环境，导致我国土壤和农产品中农药残留普遍超标。据统计，全国受农药污染的农田约1600万公顷（2.4亿亩）。除了当季使用农药污染外，30多年前使用的六六六、DDT等农药残留仍然存在，局部地区严重超标。除草剂使用导致的下茬作物药害严重，每年我国除草剂药害面积达3000万亩（其中严重受害500万亩以上）。我国农药残留污染问题已经到了非治理不可的地步。2008年某地韭菜田因前茬小麦使用氯磺隆造成的药害农药残留微生物降解技术微生物种类丰富、生长快速、代谢途径多样，可以迅速地分解自然环境中的农药残留。微生物降解作用实质是酶促反应，反应过程主要包括氧化、水解、脱卤、开环等。农药分子CO2+H2O微生物修复11%自然降解（物理化学）22%土著微生物降解67%高效降解菌降解生物修复尤其是微生物修复安全有效、成本适中、无二次污染。利用微生物进行生物修复是最有前景的方法。研究表明，接种高效降解菌剂在农药残留的降解中起主导作用。农药残留微生物降解技术从污染土壤中分离能高效降解农药残留的微生物。深入研究菌株的降解特性和分子机理。将优良菌株研制成农药残留降解菌剂。将菌剂用于农药残留的原位修复。技术核心农药残留微生物降解技术是南京农业大学首创与开发的一种新型原位生物修复技术，主要用于农药面源污染、历史残留农药清源和除草剂药害的修复。农药残留微生物降解技术二十年来，在国家“863”、国家自然科学基金、科技攻关、成果转化等50余项项目资助下，本技术建立了国内最大的保存有1000余株菌株农药降解菌的种质资源库，可降解有机氯、有机磷、菊酯类、杀菌剂类和除草剂类农药。氰戊菊酯降解菌CDT-3

溴氰菊酯降解菌LS3-9

毒死蜱降解菌DSP-1

杀螟硫磷降解菌株FDS-1滴滴涕降解菌DB-1

五氯硝基苯降解菌PCNB7CuiZL,LiSP.2001.AppliedandEnvironmentalMicrobiology.从菌株Plesiomonassp.M6中克隆出一个全新的有机磷水解酶基因mpd，该酶可以水解大多数有机磷农药。WangBZ,LiSP.2009.AppliedandEnvironmentalMicrobiology.从菌株Sphingobium

wenxiniaeJZ-1克隆出一个全新的拟除虫菊酯类农药水解酶基因pytH，该酶可以水解大多数拟除虫菊酯类农药。WangGL,LiSP.2010.JOURNALOFBACTERIOLOGY.从菌株Pseudomonassp.

CTN-3中克隆出一个全新的脱氯酶基因chd，该酶可以直接从苯环上水解脱氯。将克隆到的水解酶基因在芽孢杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统中实现重组表达，通过表达元件改造、密码子优化和发酵条件优化等手段提高重组蛋白表达量，进行酶制剂开发。ZhangXZ,LiSP.2005.AppliedandEnvironmentalMicrobiology.YuHJ,LiSP.2009.CurrentMicrobiology.在六六六高效降解菌株BHC-A中发现了LinB有7个氨基酸发生了变异，这使其能降解六六六的β异构体，并建立了由LinA和LinB组成的δ-HCH的降解途径。WuJ,LiSP.2007.EnvironmentalMicrobiology.WuJ,LiSP.2006.AppliedMicrobiologyandBiotechnology.在基因克隆和降解酶高效表达的研究中我们注重研究手段的改进，先后发展了染色体步移技术SEFA-PCR和芽孢杆菌高效遗传操作系统。ZhangXZ,LiSP.2006.NucleicAcidsResearch.WangXM,LiSP.2007.AppliedandEnvironmentalMicrobiology.YanX,LiSP.2008.AppliedandEnvironmentalMicrobiology.农药残留微生物降解技术技术的研究成果和应用农药残留生物修复技术应用于：土壤中残留的六六六、DDT、呋喃丹等农药的修复及除草剂药害的消除；大宗农作物（水稻、小麦、玉米等）、经济附加值高的蔬菜、茶叶、早竹笋、芦笋、金丝小枣、冬枣等当季使用有机磷、菊酯等农药残留的去除。已在全国10多个省建立了16个应用示范基地，创建了6个无公害绿色农产品品牌，应用推广400万亩以上，创造经济效益6亿余元，为本项目微生物修复的应用提供了技术支撑。农药残留微生物降解技术江苏射阳中草药土壤的微生物修复

六六六DDT对照处理降解率%对照处理降解率%丹参0.00750.002270.30.110.01487.4黄菊0.010.002575.20.110.03568.81对丹参和黄菊土壤中六六六和DDT的降解效率（30d）农药残留微生物降解技术浙江省临安市、富阳市针对性地联合开展了“长残留农药污染土壤原位生物修复技术”的研究与应用，长残留农药残留微生物降解菌剂已应用推广3000亩，应用后15天左右竹林地土壤DDT、六六六残留降解率可达95%以上，销售形势非常好。使用生物修复技术可提高雷竹林叶片叶绿素值、根系活力以及土壤活性强度，促进雷竹生长。农药残留微生物降解技术环太湖地区的江苏宜兴、吴江、泰兴等地万亩水稻农田土壤中DDT、噻嗪酮、毒死蜱等残留明显，经过6个月的生物修复，万亩水稻田土壤中DDT残留降解率97％以上，毒死蜱和噻嗪酮的降