第五章 分子生物学研究法(3)-核酸技术

第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

核酸的凝胶电泳

p.173

1)基本原理:

在生理条件下,核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态,所以DNA和RNA多核苷酸链是带负电的,把这些核酸分子放置在电场中,它们就会向正电极的方向移动。

迁移:

核酸分子在电场中的移动。

电泳的迁移率:

核酸分子在电场中的迁移速度。在一定的电场强度下,迁移率取决于核酸分子本身的大小和形状(超螺旋结构、开环、线性的DNA）。

这就是应用凝胶技术分离DNA片段的基本原理。

第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

2)琼脂糖/聚丙烯酰胺凝胶介质-琼脂糖是一种线性多糖聚合物,将琼脂糖加热到熔点后冷却凝固便会形成带有孔隙的电泳介质,其孔隙的大小和胶的浓度有关,浓度越高,孔隙越小,其分辨能力越强,反之则越弱。

-聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂在催化剂(如过硫酸铵)作用下形成的凝胶。-琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围是:0.2–50kb之间;聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段范围是:1-1000bp之间。

第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

表:琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力___________________________________________________凝胶类型及浓度分离DNA片段的范围(bp)___________________________________________________0.3%琼脂糖50000-10000.7%琼脂糖20000-10001.4%琼脂糖6000-3002%琼脂糖3004%聚丙烯酰胺1000-10010%聚丙烯酰胺500-2520%聚丙烯酰胺50-1___________________________________________________第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

3）核酸染色与检测染色剂：溴化乙锭(

ethidiumbromide,简称EtBr)

它的分子呈扁平状，可以插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间；在紫外光照射下,它呈现出桔黄色荧光,荧光强度与DNA片段的大小(或数量)成正比。

嵌入的EtBr分子EtBr正常DNA双链嵌入了EtBr的DNA双链图:溴化乙锭对DNA分子的插入作用第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

（1）染色方法

在熔胶冷却到~50℃时,将EtBr加入胶中,当DNA分子在凝胶介质中移动时能够吸收EtBr,但EtBr不能与凝胶介质相结合,多余的EtBr则进入到电泳缓冲液中。

把含有DNA分子的凝胶胶板浸泡在EtBr溶液中片刻,然后将胶取出,并放置在紫外光下进行观察。（2）检测将染色凝胶放置在紫外光下观察,即可检测出凝胶介质中

DNA带位置。如果在加样时,其中一个样品槽中加入DNA标记物，通过与标准DNA的谱带位置相比较,便可推测出目的

DNA片段的大小,同时还可以估计出DNA的浓度。第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

质粒DNA酶切验证图谱第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

-GoldViewI型核酸染色剂是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型DNA染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈红色荧光。

SuperGreenI型核酸染色剂

GeneFinder

核酸染色剂

溴化乙锭的无毒代替物：第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

4）脉冲电场凝胶电泳(PFGE)p.174图5-6

适用于分离50kb以上的DNA超大片段。

原理:在脉冲式交变电场中,DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期变化而不断改变。在标准的PFGE中,第一个脉冲的电场方向与核酸移动方向成45°夹角,而第二个脉冲的场方向与核酸移动方向在另一侧成45°夹角,由于凝胶质的电场方向的变化,使得DNA分子能够随时调整其移动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化。第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

图:在脉冲凝胶电泳中的等高压均匀电场获得的染色体DNA电泳图谱

家蚕病原白僵菌至少有6条染色体,估算其大小在2.5～7.2Mbp之间,3种分离菌株间存在多型性。第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

2.核酸的分子杂交

就是将待测定核苷酸序列的单链DNA或RNA与探针混合，如果DNA或RNA片段中含有与探针互补的序列,那么其相应的同源区段就会形成双链结构,反之。

探针:

是指经过特殊化合物标记的特定的核苷酸序列。

-DNA分子杂交（DNA印迹杂交,Southernblotting)

-RNA分子杂交(RNA印迹杂交

,Northernblotting)

第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

1）DNA分子杂交技术-Southernblotting

用于检测DNA片段中是否存在与探针同源的序列

因此，可以用于分析外源基因在宿主染色体DNA中的整合等情况。12345CKSouthernbloting第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

（1）DNA印迹杂交原理-基因组DNA的限制性酶切及片段的琼脂糖凝胶电泳分离-碱处理使待测定的DNA片段变性-固定在滤膜表面（转膜）-加入经标记的单链探针进行杂交-如果待测定的DNA片段存在与探针同源的序列,他们可通过碱基互补作用形成双链,根据探针标记物的特性对杂交结果进行检测。第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

（2）滤膜的种类及选择滤膜必须具备如下特点:

能很好地与DNA(RNA)分子结合不影响DNA片段与探针杂交对探针及其他物质的非特异性吸附力小具有良好的机械性常用滤膜有:

硝酸纤维素膜只能与单链DNA/RNA在高盐条件下结合,

膜与DNA片段以疏水性结合,烘干后结合能力强。但不适于电转移法；对小于200bp的片段结合力差；膜不可重复使用。

尼龙膜*二乙氨基乙基纤维素滤膜第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

（3）DNA探针的种类放射性(32P)和非放射性探针均匀标记和末端标记探针

第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

-非放射性标记物生物素(biotin):是一种水溶性B族维生素,又称维生素H。

特点：既能与核苷酸、核酸发生偶联反应又可与抗生物素蛋白/抗体等结合偶联反应：是通过生物素与dUTP分子中嘧啶碱基的第5位的碳原子之间的碳链共价结合,形成

biotin-11-dUTP和biotin-16-dUTP复合物。

第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

制备生物素标记探针：生物素-dUTP可取代dTTP而被整合进DNA探针

生物素标记的探针杂交结果可通过下列两种途径检出：

生物素-抗生物素蛋白的亲和系统

生物素-抗生物素抗体的免疫系统第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

用生物素标记DNA探针-呈色/荧光法检测杂交信号技术硝酸纤维滤膜靶标DNAPPPPPP生色或荧光诱发物质P呈色或发出荧光碱性磷酸酯酶链球菌抗生物素蛋白生物素(biotin)生物素标记的探针图:用呈色法或荧光法检测核酸杂交信号图13-9生物素标记探针检测核酸过程示意图

第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

（4）DNA分子杂交方法

-Southern斑点杂交将经变性处理的DNA样品直接点在滤膜上,固定后与探针杂交缺点：假阳性出现频率高用于快速检测基因的整合情况-Southern印迹杂交基因组DNA经酶切、电泳分离、变性、印迹转移、固定后与探针杂交和检测用检测基因的整合和拷贝数等情况

-Southern原位杂交是将变性染色体固定在玻片上与探针进行杂交。用于检测基因在染色体上整合的位置第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

基因组DNADNA限制片段凝胶电泳分离DNA变性DNA印迹转移固定、杂交检测酶切Southern印迹杂交过程图13-10Southern印迹杂交过程

Southern原位杂交第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

2)RNA分子杂交技术-Northernblotting

Northern杂交是指用从生物细胞中提取的总RNA或mRNA与探针分子杂交

因此，可用于分析外源基因在受体生物中的转录情况第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

(1)RNA印迹杂交原理

检测原理和步骤与Southern印迹杂交大致相同

不同之处：

应用变性琼脂糖凝胶电泳分离不同大小的RNA分子变性琼脂糖凝胶：在胶液中加入变性剂

甲醛常用变性剂乙二醛*等*乙二醛的两个乙醛基团可与鸟嘌呤的亚氨基团反应，形成环状衍生物以维持RNA的变性状态。

第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

为什么要使用变性琼脂糖凝胶介质？？因为只有在变性条件下电泳，破坏RNA的空间结构,才能使RNA在凝胶介质中的迁移距离与其分子质量对数值成正比。

第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

RNASecondaryStructure第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

(2)

RNA印迹杂交方法

-Northern斑点杂交用于快速检测目的基因转录情况,但不能检测出转录的mRNA片段大小。

-Northern印迹杂交用于检测目的基因转录情况,同时可以检测出mRNA转录本的大小及其转录水平等。

第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

例:Northern印迹杂交结果

图:DcLEA1基因在胡萝卜体细胞胚发育的不同阶段的表达

上图为Northern杂交结果,下图为总RNA电泳图(10ug/泳道)泳道1.调控状态下的体细胞胚泳道2-5.分别为解调控12、24、36、48h的体细胞胚

28s18s第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

注意：细胞中的总RNA包括：mRNA占1-5%rRNA80-85%tRNA和sRNA14-19%rRNA电泳后可以观察到3条特征条带：28S18S5S*因此，rRNA的特征条带是用来鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

RNA印迹杂交中注意的两点:

电泳凝胶中不加EtBr,因EtBr与RNA结合后迁移速率下降。

所有的器皿、水和试剂必须经RNase灭活处理，防止RNA的降解。

第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

内容回顾：

凝胶电泳技术难点：大于50kb片段的电泳分离。

Sourthern杂交技术难点：酶切和变性。

Northern杂交技术

难点：去除RNase；跑变性胶。

第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术

是模拟体内DNA复制过程,在体外快速扩增特定DNA

序列的方法。

第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

1)发展历史1985年，美国科学家KaryMullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术。1988年初，Keohanog通过对酶的改进，提高了扩增的真实性。1988年，Saiki等人水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。1993年，KaryMullis因此而获得诺贝尔化学奖。

第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

2)PCR反应原理

DNA聚合酶能够以引物3’-OH为起点，催化dNTP按模板顺序，合成与模板互补的新链。PCR反应的过程，即DNA解链、引物与模板DNA结合、链的延伸可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数达到2n，能满足进一步遗传分析的需要。

扩增体系包括：模板DNA（单、双链DNA）

引物4种等量混合的dNTPDNA聚合酶

DNA聚合酶的缓冲液

P.177图5-9第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

3)模板DNA的制备PCR对模板DNA的质量要求不高,可用：

细胞裂解液提取的染色体DNA

质粒DNA4)DNA聚合酶

Taq

DNA聚合酶（来自Thermusaquatics）

特点：5’—3’的聚合酶活性

5’—3’的核酸外切酶活性无3’—5’的核酸外切酶活性

扩增的DNA片段在3’有一个突出的A碱基。可以选用“T”载体进行扩增片段的克隆，常用的载体有pGEM-T，质粒两末端突出的T与片段两端突出的A互补。

第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

pfuDNA聚合酶（来自激烈热球菌Pyrococcusfariosus）

特点：

5’—3’的聚合酶活性5’—3’的核酸外切酶活性3’—5’的核酸外切酶活性扩增的DNA片段为平末端。可用开环(EcoRV单酶切)的pBluescript质粒克隆。第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

5)PCR循环参数

_____________________________________________________

温度反应时间循环数______________________________________________________

预变性94-95C45s-5min，取决于模板的复杂性1-------------------------------------------------------------------------------------------------(a)变性94-95C取决于聚合酶的种类(b)退火(anneal)取决于引物的

长度、GC含量

取决于聚合酶种类

及引物与模板的

25-30

配对程度(c)延伸72C取决于被扩增片段大小-------------------------------------------------------------------------------------------------完成72C5-10min,取决于聚合酶种类1________________________________________________________________第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

例:

PCR参数

反应体系

阶段温度时间循环数DNA模板1l预变性94℃

45’’1引物11l(50ng/l)---------------------------------------引物21l(50ng/l)变性94℃

45’’dNTPs1l(10mM/每种)退火

45’’25Pfu缓冲液5l延伸72℃Pfu聚合酶0.5l---------------------------------------H2O40.5l完成72℃

10min1Tm=55℃;PCR扩增产物长度是3044bp。PfuDNA聚合酶，每扩增1000bp需要1-2min。50℃6min第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

6)扩增产物检测用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳（片段小于100bp）。检测是否有特异性扩增产物,与标准DNA分子片段（DNAMarker）相比较，判断扩增片段的大小是否正确。

第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

例:PCR扩增产物的电泳检测

图:DcLEA1基因PCR鉴定泳道1-9：不同样本PCR扩增产物泳道M：分子量标记泳道10：阴性对照856bp1234567M8910Kb215.04.22.01.51.30.90.5第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

7)引物设计及合成

用于PCR扩增的引物，一般为15-30个核苷酸，主要通过人工合成获得。

引物设计的基本原则:

引物中的(G+C)含量应在45-65%;4种碱基应随机分布,避免单一碱基的连续排列；防止引物内部形成二级结构(loop);

两引物之间不应发生互补,尤其在引物的3’端要避免“二聚物”的形成；如需引入酶切位点，酶切位点通常放在引物的近5’端。一般情况下,引物的设计应利用计算机软件进行。

第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

2.

反转录-PCR(reversetranscribed-PCR，RT-PCR)技术

用于cDNA（complementaryDNA，互补DNA）的合成。1）原理是以提取的总RNA或mRNA为模板进行反转录合成第一链cDNA,并以此为模板，进行PCR扩增。

第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

RT-PCR反应包括：cDNA的合成

两个部分cDNA的扩增

第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

2）第一链cDNA的合成p.187-以mRNA为模板-DNA引物-由反转录酶催化-四种等量混合的dNTP

使用什么引物????第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

以olig(dT)为引物合成mRNA的第一条cDNA链。P.187

5′

AAAAAA3′mRNA

3′TTTTTTT5′cDNA反转录酶

olig(dT)引物

mRNA3’端的互补序列为引物

5′AAAAAA3′mRNA3′5′cDNA

反转录酶

特异引物随机引物RT-PCR过程示意图第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

3）第二链cDNA合成

-以第一链cDNA为模板-引物-由DNA聚合酶催化-dNTP引物从何而来??第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

cDNA第二链的合成方法有两种:自身引导法

-第一条cDNA链合成后，cDNA:RNA

杂交链变性；

-

利用单链cDNA3’端能够形成一短的发夹结构，为第二条cDNA链的合成提供引物；

-由大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段催化合成第二

条cDNA链；

-用对单链特异性的S1核酸酶切除末端的发夹结构，得到cDNA双链。缺点：合成反应较难控制，而且用S1核酸酶切割发夹结构时会导致末端序列的缺失，因而该方法目前很少使用。第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

置换合成法第一条cDNA链合成后，产生的cDNA:mRNA

杂交链无需变性。

-用RNaseH酶切割杂交链中的mRNA链，在mRNA链上造成切口和缺口，利用一系列小的RNA片段为引物。

-由大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ催化合成第二条cDNA链。

-最后由DNA连接酶将小的cDNA片段连接成完整的

cDNA链。

第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

RNaseH：-是一种核糖核酸内切酶，特异性水解DNA：RNA杂交链中RNA链。-该酶对单链的核酸、双链DNA或双链RNA没有作用。

第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

置换合成法的优点:

-非常高效。-直接利用第一链反应产物，无须进一步处理和纯化。-不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环，能保持cDNA序列的完整性。是目前合成cDNA常采用的方法。第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

cDNA的扩增以cDNA单链或双链为模板，在特异性引物的引导下，进行PCR扩增。第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

4）cDNA文库的构建p.188

cDNA文库：

从真核生物的组织或细胞中提取各种RNA，通过RT-PCR合成cDNA，将双链cDNA分别和适当载体连接后，转化宿主细胞，所获得菌落或噬菌体的集合即为该生物的cDNA文库。

克隆载体：cDNA的长度一般在0.5-8kb。常用载体有：质粒载体和噬菌体载体。

cDNA文库的构建过程cDNA文库的用途：-可用于真核生物基因的克隆、表达和调控的分析;-比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

3.反向PCR(reversePCR)

用于扩增已知DNA区段之外的末知序列。

原理:先用一种已知

DNA区段上没有切割位点的限制性内切酶,从已知

DNA区段有一定距离的两侧位置切割DNA分子,然后将这些片段作分子内连接成环形。根据己知的靶DNA序列按向外延伸的要求设计一对引物,保证被扩增的是位于靶DNA区段两侧的末知DNA序列。

第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

引物1引物2引物1引物2图:反向PCR的基本操作程序引物2第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

Sanger双脱氧链终止法

(Sanger和Coulson，1977)Maxam-GilbertDNA化学降解法

(Maxam

和Gilbert，1977)DNA自动测序法质谱法单分子测序法原子探针显微镜测序法流式细胞仪测序法大规模平行测序法、DNA芯片法

经典方法新方法第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

1.Sanger双脱氧链终止法（引物合成法）1）

原理:利用DNA聚合酶在体外合成DNA时，能够将2’,3’-ddNTP（双脱氧核糖核苷三磷酸）掺入到寡核苷酸链的3’-末端这一特点设计。

第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析5´3´5´5´3´3´ddNTP掺入到DNA合成反应后导致反应终止正常的DNA合成反应第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

在测序反应体系中加入：

-模板DNA(3’5’的单链)-特异性引物（带标记的）

-DNA聚合酶（测序酶）

-dATP、dTTP、dGTP、dCTP和一种ddNTP

在合成反应中，当这种2’,3’-双脱氧ddNTP加到寡核苷酸链生长末端,由于ddNTP没有3’-OH基团,寡核苷酸链不能继续延长。在同一反应中,将会合成出不同长度的DNA片段混合物，这些片段具有相同的5’-末端和以ddNTP结束的3’-末端。第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

将这种混合物加到可以区分长度仅差一个核苷酸的不同

DNA片段的变性凝胶中进行电泳分离,就可以获得一系列全部以3’-末端ddNTP为终止残基的DNA片段的电泳图谱。通过放射自显影的方法检测单链DNA片段的放射性条带,

就可以直接读出DNA的核苷酸顺序。

第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

双脱氧链终止法测序的基本原理和过程

凝胶电泳方向3’AGTTGCTA5’测序胶的判读*放射性标记(测序酶)第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

2.Maxam-GilbertDNA化学降解法

1）原理:

用化学试剂处理末端带有放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此在同一反应中产生具有共同起点(放射性标记末端)到发生化学切割位点的一组长度不同的DNA片段。反应混合物经凝胶电泳分离和放射自显影之后,便可根据X光片底板上所显现的相应谱带,读出DNA片段的核苷酸顺序。第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

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