改进质粒dna提取方法的研究

改进质粒dna提取方法的研究

通过传统的碱裂解法提取的细菌物质、物质和盐的产物通常含有大量的蛋白质、盐和其他污染物，提取过程相对复杂。所使用的试剂对人体有害，得率相对较低，试验结果也不稳定。本实验的创新的点在于结合了常规碱裂解法和Mini质粒提取的优点,在工程菌生长至对数期时加入氯霉素抑制细菌蛋白质的合成,但不影响松弛型质粒DNA的复制,为质粒DNA的提取过程中蛋白质的去除提供了方便,还可以达到提高质粒DNA产量的目的,由于细菌长期受到抑制使裂解液中的黏稠度显著降低,向培养基中添加氯霉素比处理黏稠的裂解液更方便,同时利用LiCl沉淀RNA,并简化操作流程,使提取时间缩短,并且在操作过程中去除了酚、氯仿等对人体有害的试剂,使试验本身对操作者的危害得以降低,从而建立了一套完整、便捷、质粒DNA得率和纯度高、且相对比较安全的大肠菌质粒DNA的提取方法,可直接用于PCR和限制性酶切等分子生物学实验操作。1材料和方法1.1培养基和仪器1.1.1实验材料E.coliM15为本实验室收藏菌种;质粒pREP4为清华大学赠送、本实验室保存。1.1.2实验试剂1.1.2.1DNAMarker购自华美公司;其他各种常规化学试剂均为分析纯。1.1.2.2氨苄青霉素(Amp):配成50mg/mL水溶液,-20℃保存备用。1.1.2.3LB培养基、SolutionⅠ、SolutionⅡ、SolutionⅢ、STE、TE配制参见。1.1.2.4RNA酶A母液:将RNA酶A溶于10mmol/LTris-Cl(pH7.5)15mmol/LNaCl,配成10mg/mL的溶液,于100℃加热15min,使混有的DNA酶失活,冷却后用1.5mLep管分装保存与-20℃。1.1.2.5LiCl(8mol/L):100mL。1.1.2.6NH4AC(8mol/L):100mL。1.1.3仪器:离心机;PCR仪;凝胶成像系统。1.1.4培养基:LB培养基,按《分子克隆实验指南》说明配制。1.2重组质粒dna的检测1.2.1含重组质粒DNA细胞的培养与收集将含有质粒CyPA的M15菌种接种在LB固体培养基(含50μg/mLAmp)中,37℃培养12-16h。挑取转化细胞的单菌落,接种到50mLLB液体培养基(含50μg/mLAmp)中,37℃振荡培养约12-16h(当菌液生长到对数期OD600=0.4-0.6在培养液中添加适当体积的34mg/mL的氯霉素,使其终浓度为170μg/mL)。1.2.2优化的碱裂解法提取质粒DNA(1)12000r/min离心30s,收集1.5mL培养物中的菌体,尽量弃尽上清,倒置片刻;(2)将细菌沉淀重新悬浮于1mL用冰预冷的STE中,同上离心(此步可以重复)。(3)加入100μl溶液Ⅰ,在涡旋器上使菌体充分重悬;或用微量移液器混匀;(4)加入200μl溶液Ⅱ,立即将离心管缓慢颠倒数3-5次直到溶液变澄清,冰浴2min;(5)加入150μl溶液Ⅲ,缓慢颠倒离心管3-5次直至白色絮状物充分形成,冰浴2min;(6)12000r/min离心2min后将上清转入另一管中,加入2V的800μl95%乙醇,混匀,静止5min,12000r/min离心3min;弃上清。(7)加入200μlTE溶解沉淀,然后再加入100μl冰预冷的8mol/LiCl溶液和100μL冰预冷的8mol/L的NH4AC,冰浴10min后12000r/min离心3min,使RNA和大量蛋白质杂质沉淀;(8)取上清,加入RNA酶A母液,使得最终RNA浓度为20μg/mL,37℃保温5-10min。(9)加入2倍体积的95%乙醇,混匀,静止5min,12000r/min离心3min;弃上清。70%乙醇洗涤后12000r/min离心2min;弃上清,置于37℃培养箱干燥5min,用30μl的TE溶解DNA沉淀,-20℃保存备用;(10)取适量质粒DNA用于分光光度计定量。1.2.3重组质粒DNA的电泳检测制备0.8%琼脂糖凝胶,取1μl样品进行凝胶电泳检测。以传统的碱裂解方法所提的质粒DNA做对照。1.2.4重组质粒DNA的限制性核酸内切酶检测酶切方法见《分子克隆实验指南》第三版。1.2.5质粒DNA的定量及杂质检测采用分光光度计法,样品稀释100倍后,分别测定OD260和OD280值,若OD260/OD280>1.8,表明DNA中含有RNA杂质;若OD260/OD280<1.6,表明样品中含有蛋白质等杂质;OD260=1.0时,相当50μg/mL的DNA。1.2.6重组质粒DNA的PCR检测按以下次序,将各成分加在0.5mL灭菌扩增管中混合:10×扩增缓冲液5μl20mmol/L4种dNTP混合液(pH8.0)2μl25μmol/L正向引物2μl25μmol/L反向引物2μl1-5U/μLTaqDNA聚合酶3μlddH2O30μl模板DNA2μl1.5mmol/LMg2+5μl总体积50μl按以下程序进行PCR扩增。预热95℃7min;95℃50s,57℃50s,72℃50s30个循环;72℃7min4℃forever。2结果与分析2.1dna的形态从图1可以看出,改进质粒提取方法的得率优于传统的方法,而且质粒DNA的质量好,主要以超螺旋形式存在,几乎无RNA杂质,而常规方法所取得的质粒的RNA含量较高,而且常规碱裂解法所提取的DNA主要以缺刻形式为主,说明DNA的状态受到了极大的影响。Lane1:GelelectrophoresisofplasmidDNAextractedbymodifiedalkalinelysismethod;Lane2,3:GelelectrophoresisofplasmidDNAextractedbyalkalinelysismethod.2.2酶消化系统中的dna检测图2的结果表明,重组质粒DNA被酶切成两个正确的目的片段。用改进方法所提取的质粒DNA完全可以满足限制性核酸内切酶进行酶切的要求。2.3pcr扩增结果PCR检测改进方法所提取重组质粒DNA,图3可知,扩增出目的大小为700bp的片段。以上结果表明,用改进的方法提取的质粒DNA也同样可用于一般的分子生物学如进行限制性核酸内切酶,PCR等实验的要求。2.4dna的纯度测得改进方法提取的质粒的OD260=0.979,OD280=0.547,质粒DNA的OD260/OD280=1.789。表明提取质粒中杂质较少,经典的碱裂解方法所提取的质粒DNAOD260/OD280=1.903。以上结果表明,从获得质粒DNA的纯度来看,改进的方法优于经典的方法;从质粒DNA产率上来讲,改进的方法也毫不逊色于经典的方法,高达20μg/mL。而常规方法所提取的DNA中RNA的杂质含量较高。M:DNAMarker;Lane1:RestrictionanalysisofplasmidDNAextractedbymodifiedalkalinelysismethod;Lane2:plasmidDNAextractedbyalkalinelysismethod.Marker:lambdarDNAEcoRⅠ/HindⅢ;ck-:thenegativegroup;ck+:PCRtestingofplasmidDNAextractedbyalkalinelysismethod.3licl沉淀经典的碱裂解法方主要是根据大肠杆菌细胞的特殊性,在提取时加入NaOH进行碱裂解,并在提取后加入酚、氯仿等进行纯化处理,质粒DNA产率较高,该方法具有好的可行性,是常用的方法,但该方法的缺点在于操作过于繁琐,且所使用药品对操作人员有直接或间接危害。改进的质粒DNA提取方法结合了常规碱裂解法和Mini质粒提取的优点,并结合简化操作流程和严格反映环境条件,使提取时间缩短,并且在操作过程中去除了酚、氯仿等对人体有害的试剂,使试验本身对操作者的危害得以降低。该方法采用LiCl沉淀去除质粒制备物中小片段核酸(包括DNA和RNA)的原理是基于两种核酸在LiCl溶液中的溶解度有所不同。LiCl是强脱水剂,可降低RNA的溶解度,并剥离染色体上的蛋白质。因此,质粒粗提物中的高分子质量RNA和蛋白质可在高浓度LiCl和NH4AC溶液中形成沉淀,从而可通过离心加以分离。用LiCl溶液处理DNA溶液,可以沉淀大量的RNA,减少或不用RNA酶的消化时间;用95%乙醇沉淀质粒DNA可以大大降低终产物中盐和糖等污染物的含量而且不影响DNA的产量。这样做也可以确保产物的纯净和实验结果的稳定,避免重复实验。在实验中我们注意到减少溶液Ⅱ和Ⅲ的处理时间并不影响质粒DNA的产量和质量,因此将该步骤时间缩短至2min。在工程菌生长至对数期时加入氯霉素可以抑制细菌蛋白质的合成,但不影响松弛型质粒DNA的复制,为质粒DNA的提取过程中蛋白质的去除提供了方便。同时氯霉素可使质粒的拷贝数进一步增加,可以达到提高质粒DNA的产量的目的,由于细菌长期受到抑制使裂解液中的黏稠度显著降低,这样向培养基中添加