五灵脂药材的加速溶剂萃取-高效液相色谱法测定

五灵脂药材的加速溶剂萃取-高效液相色谱法测定

第五灵脂是大鼠科动物牙齿氧化的干燥大便，分为灵脂米和灵脂块。五灵脂中主要含有含氮化合物,三萜类化合物,酚酸类及简单单萜、二萜酸,维生素样物质、树脂和无机盐等。五灵脂为活血化瘀的中药材,《本草纲目》曰:“五灵脂,足厥阴肝经药也。气味俱厚,阴中之阴,故入血分”,“主治心腹冷气,小儿五疳,辟疫,治肠风,通利气脉,女子血脉”。芦丁、山奈酚和穗花杉双黄酮属于黄酮类化合物,有抗过敏、抗菌、抗炎和治疗心脑血管疾病等功能。目前关于五灵脂中活性物质的测定方法主要是液相色谱法和薄层色谱法,其前处理方法主要使用超声提取和水浴加热提取两种方式,具有耗时长、试剂用量大、溶剂挥发多的缺点。加速溶剂萃取技术是近年发展起来的一种在高温(低于200℃)、高压(低于20MPa)条件下快速提取固体或半固体样品的前处理方法,与常用的水浴加热提取、超声提取和微波萃取技术等方法相比,可大大缩短萃取时间,提高萃取效率,减少萃取溶剂用量,显著降低了单个样品的提取费用。本工作采用加速溶剂萃取-高效液相色谱法测定了五灵脂药材中芦丁、山奈酚和穗花杉双黄酮的含量。1试验部分1.1药品、试剂与标准品Waters2695型液相色谱仪,配紫外检测器;MS3型涡旋仪;SK8200LH型超声仪;Milli-QⅡ型高纯水发生器;T-124型离心机;RE-52AA型旋转蒸发仪;ASE200型加速溶剂萃取仪;JULABOF34型恒温水浴。标准储备溶液:100mg·L-1,称取适量的芦丁(纯度为90%)、山奈酚(纯度为97%)和穗花杉双黄酮(纯度为99%)标准品,用甲醇为溶剂配制成,储存于-18℃冰箱,保存期为18个月。使用时用甲醇稀释至所需质量浓度。样品提取溶液:乙醇-水(75+25)混合溶液。甲醇、乙腈为色谱纯;五灵脂的样品为某地区市售和某进口样品;其余试剂均为优级纯;试验用水为二次净化水。1.2u3000梯度洗脱程序1)色谱条件DiamosilODSC18色谱柱(4.6mm×250mm,5.0μm);流动相:A为甲醇,B为乙酸(0.5+99.5)溶液。梯度洗脱程序:0~10min时,A由85%降至60%;10~15min时,A由60%降至35%;15~22min时,A由35%降至15%;22~28min时,A由15%升至85%,保持7min。进样量10μL;流量1.0mL·min-1;柱温为35℃;检测波长为360nm。2)加速溶剂萃取条件溶剂为乙醇-水(75+25)溶液;温度100℃;压力15MPa;预热时间5.0min,静态萃取时间10.0min,循环次数为3次。1.3海沙地平砂萃取称取试样1.0000g,加海沙3.0g混匀后,置于11mL加速溶剂萃取池中(下部先添加少量海沙),上部添加海沙至平,拧紧萃取池帽,放入加速溶剂萃取池盘中,按AES条件进行萃取,萃取后,接收池溶液旋转蒸发至3mL,用提取溶液定容至5mL,过0.2μm的再生纤维素膜,按色谱条件进行测定。2结果与讨论2.1铬行为按色谱条件对1.0mg·L-1的芦丁、山奈酚和穗花杉双黄酮混合标准溶液进行测定,其色谱图见图1。2.2流动相的选择参考待测物的性质和文献,待测物属于中等极性,可选择反相C18色谱柱分离待测物。试验通过比较不同流动相甲醇和酸性(乙酸和磷酸)水溶液与乙腈和酸性(乙酸和磷酸)水溶液,依据基线噪声的高低和目标物与杂质的分离度选择流动相。结果表明:甲醇和乙酸(0.5+99.5)溶液作为流动相时,芦丁、山奈酚和穗花杉双黄酮都具有较低的噪声和较好的分离度。2.3提取压力和提取时间按试验方法考察了超声提取、恒温水浴加热提取和加速溶剂萃取等3种方式对测定的影响。结果表明:加速溶剂萃取萃取时间短,溶剂用量少,提取效率高,为最优选择。加速溶剂萃取的条件主要有温度、压力、静态提取时间和循环次数等。萃取条件以提取率为依据进行选择。试验首先用水浴加热经长时间反复提取某五灵脂样品(含有3种待测物),当测定的3种物质的含量水平基本无变化时,确定提取完全,获得该样品中3种物质的实际含量值。提取率为一定条件下提取后测定值占其实际含量值的百分数。如ASE的其它条件不变,循环1~5次的提取率依次为52%,80%,96%,98%,98%,可以看出:循环3次已基本提取完全。用同样方法选择ASE的其它萃取条件。试验选择温度为100℃,压力为15MPa,预热时间为5.0min,静态提取时间为10.0min。2.4标准曲线的绘制按色谱条件对芦丁、山奈酚和穗花杉双黄酮标准溶液系列进行测定,以质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。芦丁、山奈酚和穗花杉双黄酮的线性参数见表1。以3倍信噪比计算方法的检出限(3S/N),以10倍信噪比计算方法的测定下限(10S/N),结果见表1。2.5准确度和回收率按试验方法对五灵脂样品进行测定,同时添加3个浓度水平进行回收试验,每个水平重复5次,回收率和精密度的试验结果见表2。2.6样品的色谱图按试验方法对20个五灵脂样品进行测定,根据化合物的色谱保留时间和光谱图来鉴别样品。结果表明:所测定样品中芦丁、山奈酚、穗花杉双黄酮的质量分数依次在0.02%~0.3%,0.03%~0.1%,0.01%~0.09%之间。五灵脂样品的色谱图见图2。本工作采用乙醇水溶液