高脂饲料配方及周龄对sd大鼠模型胰岛素抵抗的影响

高脂饲料配方及周龄对sd大鼠模型胰岛素抵抗的影响

高脂饮食、腹腔注射速尿素（stz）是目前广泛使用的2型糖尿病模型的制备方法。该模型具有许多与临床2型糖尿病类似的生化代谢及临床特点,是研究2型糖尿病的较为理想的动物平台。综观目前对于此种模型建立方法的研究报道,造模方法尚不统一,各位研究者采用的高脂饲料配方和造模动物周龄各不相同,导致研究结果难以复制或进行平行比较。因此,对于不同造模方法需要进行实验研究进行比较,以筛选出最优造模方法。前人研究中,关于造模采用的大鼠周龄以及饲料配方对于模型建立成功率影响的研究鲜有报道。为优化造模方法,建立稳定且成模率高的动物模型,本研究观察不同配方的高脂饲料,以及不同周龄的大鼠对于该模型的造模成功率和模型病变特点的影响,以筛选出更适合建立此种模型的高脂饲料配方和大鼠周龄,为造模方法的优化提供实验依据。1材料和方法1.1实验动物及饲养清洁级雄性3周龄(刚断乳)SD大鼠26只,体重(60±10)g;清洁级雄性5周龄SD大鼠26只,体重(120±10)g,来源于北京维通利华实验动物中心[SCXK(京)2006-0001],饲养于北京中医药大学实验动物中心[SYXK(京)2006-0012],室温20℃~25℃,相对湿度50%~60%,并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。1.2主要成分的热量比普通饲料和高脂饲料均由中国医学科学院实验动物研究所加工提供。高脂饲料配方一:猪油18%、蛋黄粉10%、大豆油2%、蔗糖10%、酪蛋白20%、蛋氨酸0.3%、淀粉21.7%、糊精9%、纤维素7.5%、胆碱0.3%、多维预混料0.1%、多矿预混料0.8%、胆酸钠0.3%。配方中主要成分提供的热量比为:猪油35.8%、蛋黄粉15.4%、大豆油4.3%、蔗糖9.6%、酪蛋白17.3%、淀粉17.6%。高脂饲料配方二:猪油12%、蛋黄粉10%、大豆油2%、花生5%、奶粉5%、蔗糖8%、酪蛋白20%、蛋氨酸0.3%、淀粉21.2%、糊精7%、纤维素7.5%、食盐0.5%、胆碱0.3%、多维预混料0.1%、多矿预混料0.8%、胆酸钠0.3%。配方中主要成分提供的热量比为:猪油24.5%、蛋黄粉15.6%、大豆油4.4%、花生6.8%、奶粉5.9%、蔗糖7.8%、酪蛋白17.6%、淀粉17.4%。1.3试剂柠檬酸(批号:0602102),柠檬酸钠(批号:20070403),购自北京化学试剂公司;STZ,Sigma公司。1.4stz配置配制0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,调节pH为4.4;配制1%STZ溶液,溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,在冰浴中操作。1.5动物分组m组按体重将26只3周龄大鼠随机分为3组:正常一组(N1组)、模型一组(M1组)和模型二组(M2组),其中N1组6只动物,M1组和M2组每组各10只动物。按体重将26只5周龄大鼠随机分为3组:正常二组(N2组)、模型三组(M3组)和模型四组(M4组),其中N2组6只动物,M3组和M4组每组各10只动物。1.6高脂饲料配方模型N1组和N2组给予普通饲料。各模型组大鼠给予高脂饲料喂养。其中M1组和M3组给予高脂饲料配方一喂养,M2组和M4组给予高脂饲料配方二喂养。4周后,各模型组大鼠腹腔注射STZ溶液35mg/kg;正常组腹腔注射同等剂量0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。尾静脉采血测定空腹血糖(FBG),并进行口服葡萄糖耐量试验(oralglucosetolerancetest,OGTT),凡空腹血糖值≥7.8mmol/L者纳入实验。1.7指标检测1.7.1血糖、血脂指标检测各组动物在给予高脂饲料前、注射STZ前及注射STZ4周后(处死前)测量体重、24h摄食量、饮水量;注射STZ前1d各组经尾静脉采血测定空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FIN)、总胆固醇(TG)、甘油三酯水平(TC)。注射STZ后,各组动物每周测定FBG一次。STZ注射后7d以及STZ注射4周后各组大鼠测定OGTT。STZ注射4周后,经腹主动脉取血检测FBG、FIN、TG、TC水平,并处死所有动物。血糖采用美国强生公司的Onetouch随手测血糖仪及血糖试纸测定。血清胰岛素采用中国原子能科学研究院I1252胰岛素放射免疫分析药盒测定,用大鼠标准品绘制标准曲线。血清TC、TG由全自动生化分析仪完成测定。1.7.2葡萄糖曲线下面积大鼠禁食15h后,灌胃给予20%的葡萄糖溶液2g/kg。检测0min及葡萄糖灌胃后30、60、120min的血糖,计算葡萄糖曲线下面积(AUC)=(血糖值0min+血糖值30min)×0.5/2+(血糖值30min+血糖值60min)×0.5/2+(血糖值60min+血糖值120min)×1/2。1.8统计方法采用SPSS13.0统计软件处理。数据用表示,组间比较用one-wayANOVA方差分析。2结果2.1动物体重和stz4周后给予高脂饲料前,各模型组大鼠与各自对照的正常组大鼠的体重水平无明显差异(P>0.05);注射STZ前,M1组和M3组动物体重均显著低于各自对照组水平(P<0.01),M2组和M4组动物体重均显著高于各自对照组水平(P<0.01);注射STZ4周后,M1组和M3组动物体重均显著低于各自对照组水平(P<0.01),M2组和M4组动物体重与各自对照组相比无明显差异(P>0.05)。详见表1。2.2动物24h摄食量和饮水量给予高脂饲料前,各模型组大鼠与各自对照的正常组大鼠的24h摄食量和饮水量水平无明显差异(P>0.05);注射STZ前,M1组和M3组动物的24h摄食量均显著低于各自对照组水平(P<0.01),M2组和M4组动物的24h摄食量均明显高于各自对照组水平(P<0.05);注射STZ后4周,M1组和M3组动物的24h摄食量均显著低于各自对照组水平(P<0.01),M2组和M4组动物的24h摄食量均显著高于各自对照组水平(P<0.01);各模型组大鼠的24h饮水量均显著高于各自对照组水平(P<0.01)。详见表2。2.3stz分次注射前后血糖水平变化的变化见表1、表4M1组和M2组的动物在注射STZ后FBG水平先升高后降低,在STZ注射后2周时达到最高值然后逐渐降低,至STZ注射后4周观察结束时仍呈下降趋势,因此认为此两组动物的FBG水平在STZ注射后4周内尚不稳定。M3组和M4组的动物在注射STZ后FBG水平先升高,在STZ注射后2周时达到高值,至STZ注射后4周观察结束时一直处于比较稳定的状态,因此认为此两组动物的FBG水平在STZ注射后2周即达到稳定状态。M1、M2、M3组的FBG水平在STZ注射后3周均明显低于M4组水平(P<0.05);在STZ注射后4周均显著低于M4组水平(P<0.01)。见表3。2.4动物tg、tc、fin水平的比较注射STZ前,M2组和M4组动物的FIN、TG和TC水平均显著高于各自对照组水平(P<0.01),M1组和M3组动物的TG水平均显著高于各自对照组水平(P<0.01);注射STZ4周后,M2组和M4组动物的FIN水平均明显高于各自对照组水平(P<0.05),TG和TC水平均显著高于各自对照组水平(P<0.01),M1组和M3组动物的TG水平均显著高于各自对照组水平(P<0.01)。详见表4。2.5造模成功率各模型组大鼠成功建立2型糖尿病模型的比率如下:M1组10只大鼠,6只造模成功,造模成功率为60%;M2组10只大鼠,6只造模成功,造模成功率为60%;M3组10只大鼠,7只造模成功,造模成功率为70%;M4组10只大鼠,9只造模成功,造模成功率为90%。2.6两组对照组水平比较注射STZ后7d及注射STZ后4周,所有模型动物的AUC值均显著高于各自对照组水平(P<0.01);注射STZ后4周,M1组和M2组的AUC值均显著低于M4组水平(P<0.01),M3组的AUC值明显低于M4组水平(P<0.05)。见表5。3大鼠周龄模型的建立流行病学的研究提示,高糖、高脂肪的高热量饮食,会诱发IR,增加患2型糖尿病的风险,是2型糖尿病发病的重要因素。这种高热量饮食可减弱胰岛素抑制肝糖输出的能力,并影响葡萄糖刺激胰岛细胞的胰岛素分泌。本研究观察了不同配方的高糖高脂饲料,以及不同周龄的大鼠对于该模型的造模成功率和模型病变特点的影响,以筛选出更适合建立此种模型的高脂饲料配方和大鼠周龄,改进造模方法。本研究结果提示,高脂喂养合并腹腔注射小剂量STZ制备2型糖尿病大鼠模型,选取5周龄SD大鼠较为适合,其FBG水平在注射STZ后两周即可达到稳定状态,并维持在较高的水平;高脂饲料配方二更容易被动物接受,摄食量和体重增加明显,并且成功诱导出IR,更加符合2型糖尿病模型的要求。选取5周龄SD大鼠作为模型动物,并给予配方二高脂饲料喂养,所建立的大鼠模型血糖、胰岛素以及血脂谱(TC、TG)均明显升高,具备高血糖、高胰岛素血症、血脂异常等2型糖尿病的主要特征,是值得推广的2型糖尿病动物模型。综观目前的研究报道,对于建立此种模型采用的大鼠周龄鲜有研究者进行探讨,大鼠周龄的选择范围较大,从断乳(约出生后3周)到8周龄均有报道。大鼠的生长和发育特性随周龄不同而存在较大差别,对环境因素(如营养因素)的反应也不同。有研究者认为,刚断乳的大鼠未接受过普通饲料饲养,对于高脂饲料更加易于接受,因此认为采用刚断乳或断乳不久的大鼠进行实验效果较好。本研究结果发现,3周龄的大鼠与5周龄的大鼠相比,对于同种高脂饲料的24h进食量无明显差异,血清FIN、TG和TC水平无明显差异。但两组给予不同高脂饲料的3周龄大鼠与两组5周龄大鼠相比,造模成功率明显低于5周龄大鼠,并且造模后4周内其FBG水平明显低于5周龄大鼠。两组3周龄大鼠的FBG水平在造模后4周内均出现先升高后降低的趋势,在观察时间内FBG水平未达到稳定状态。认为可能与幼龄动物处于生长发育的高峰期,对于外界干预损伤的自愈能力较强有关。但是作为模型动物,在没有药物及其他干预的情况下,FBG水平在较长的时期内一直处于波动状态,是不利于进行药物干预研究的。本研究结果提示,5周龄大鼠是较为适合的造模动物,其FBG水平在注射STZ后两周即可达到稳定状态,即可进行药物干预研究。目前的文献报道中大多是在普通饲料中添加10%~20%左右的脂肪,5%~20%左右的蔗糖,另有研究者添加鸡蛋、花生、奶粉、食盐等。饲料中脂肪比例增加是形成肥胖和胰岛素抵抗的重要环境因素。文献报道,脂肪热卡从10%增加到59%,碳水化合物由69%降至20%,4周内可以观察到大鼠体内脂肪堆积,外周组织和肝脏产生胰岛素抵抗,体内葡萄糖利用率下降超过50%。但是,脂肪含量过高的高脂饲料存在难以干燥、质软易碎、口感较差的缺点。配方一中含有18%的猪油,饲料易碎,约有1/3的饲料都是碎末或渣滓而无法使用。食用此种饲料的两组大鼠24h摄食量均显著低于正常饲料组和配方二组,且大鼠体重增长缓慢,体重显著低于同周龄的正常饲料组和配方二组动物。检测结果提示,服用配方