环境微生物学实验报告实验一到三

实验一

显微镜油镜的使用和细菌形态的观察一、实验目的1、了解显微镜的基本构造和使用方法2、掌握油镜的原理和使用方法3、了解细菌的三种基本形态二、显微镜的基本构造三、油镜使用的原理油镜，即油浸物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量和显微镜的分辨率从而使物象更加清晰。四、实验器材1、细菌三态装片2、显微镜3、香柏油4、擦镜纸等五、操作步骤1.放置好显微镜2.调节光源3.低倍镜观察4.高倍镜观察5.油镜观察6.清洁和还原显微镜显微镜观察细菌涂片（细菌三型涂片、枯草杆菌涂片）使用油镜：

低倍镜（10×）高倍镜（40×）油镜（100×）1.放置好显微镜置显微镜于平稳的实验台上。镜检者姿势要端正。（不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录2.调节好光源接通电源，打开光源。3.低倍镜的观察观察任何标本都必须先用低倍镜观察，因为低倍镜视野范围大，容易发现观察目标，确定观察部位。将标本片放在载物台上，用标本夹夹住，调节标本移动螺旋，使观察的目的物处于物镜的正下方。调节粗调螺旋，使物镜（10×）与标本靠近，眼睛在测向注视物镜，防止物镜和载玻片相碰。张开双眼向目镜里观察，如果见到目的物，但不十分清楚，可用细准焦螺旋调节，至目的物清晰为止。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部分，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。4.高倍镜的观察（1）用低倍镜找到标本并调节清晰后，将欲放大的观察部位用推进器调到视野中央。（2）.旋动转换器换高倍镜。如果高倍镜下观察目的物有点模糊，调节细准焦螺旋，直到视野清晰。调节细准焦螺旋时要注意旋转方向与载物台上升或下降的关系，防止镜头与载玻片强力接触，损坏镜头或载玻片。5.油镜的观察（1）如果用高倍镜目的物未能看清，可用油镜。先用低倍镜和高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。下降载物台，在载玻片上滴一滴香柏油，将油镜移至正中，缓慢调节粗调螺（2）旋使油镜头浸没在油中，刚好贴近载玻片。然后再用细准焦螺旋微微向上调（切忌用粗准焦螺旋）即可。（应特别注意不要在升降载物台时用力过猛，或者调焦时误将粗调节螺旋向反方向转动而损坏镜头及载玻片）6.清洁显微镜和还原显微镜.观察结束后，调节光源到最小再关掉电源开关。调节粗调螺旋，使载物台下降到最低，取下玻片。.把油镜转离光轴，擦镜纸擦1～2次，去油，用二甲苯滴湿的擦镜纸擦2次，再用擦镜纸擦1～2次，顺镜头直径方向擦，不要圆周擦和来回擦。擦干净镜体，罩上防尘罩，然后放回原处。.用擦油镜头的方法擦玻片。六、显微结构图的绘制

严格按光学显微镜的操作方法，依低倍、高倍及油镜的次序观察细菌装片，并绘出其形态图。生物绘图中绘出的图要清楚，并正确的表示出形态构造的特点，绘图注意事项如下：(1)绘图要用黑色硬铅笔，不要用软铅笔或有色铅笔，一般用2H铅笔为宜。(2)图的大小及在纸上分布的位置要适当。(3)画图时先用轻淡小点或轻线条画出轮廓，再依照轮廓一笔画出与物象相符的线条。线条要清晰，比例要准确。(4)绘出的图要正确，观察时要把混杂物、破损、重叠等现象区别清楚，不要把这些现象绘上。(5)图的明暗及浓淡，应用细点表示，不要采用涂抹方法。点细点时，要点成圆点，不要点成小撇。(6)整个图要美观、整洁，还要特别注意准确性。七、思考题1、使用油镜时，为什么要先用低倍镜观察？2、油镜使用原理是什么？3、绘出细菌三型图。实验二细菌的简单染色虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。本实验通过对细菌的染色观察，使同学们在掌握细菌染色技术的基础上，了解各种其他的染色制片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。一、目的要求1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。2．巩固显微镜的使用方法。二、基本原理1.简单染色法：所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子：带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystalviolet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。三、器材1、活材料：培养24小时的大肠杆菌、葡萄球菌。2、染色液和试剂：草酸铵结晶紫、番红、蒸馏水、无菌水、二甲苯、香柏油等。3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。四、操作步骤（1）涂片：取干净载玻片一块，左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上灼烧灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂直径约0.5-1cm的均匀薄膜。如果从斜面或平板上取菌，用无菌环挑取少量菌体，涂在预先滴有一小滴无菌水的载玻片上，使其薄而均匀。（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜），使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加一滴草酸铵结晶紫染色1-2min（5）水洗：用洗瓶或滴管缓慢冲洗涂片上的染色液，直至冲下之水无色时为止。（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。（8）改用番红染色，重复以上过程。实验完毕后的处理：①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。②观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。五、注意事项（1）要有对数生长期的菌种菌龄过小或过大均影响细菌的正常形态，菌龄太小还没有分化完整，而菌龄过大，往往会发生自溶。（2）涂片不宜过厚，以免造成菌体重叠，不利于观察形态。（3）火焰固定不宜过热，否则会使细菌变形。六、实验报告1．结果绘出葡萄球菌和大肠杆菌的形态图。2．思考题简单染色应注意哪些，为什么？实验三细菌的革兰氏染色一.目的要求1.初步掌握细菌涂片方法2.学习并掌握革兰氏染色法步骤二.革兰氏染色的基本原理革兰氏染色是丹麦医生C.Gram（革兰）于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。根据细菌细胞壁的组分和结构不同，通过革兰氏染色法可将所有的细菌区分为两大类G+和G-.三.实验材料（一）菌种：1.金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)斜面培养物2.大肠杆菌(E.coli)培养物（二）仪器与其他用品显微镜、酒精灯、火机（火柴）、接种环、载玻片、擦镜纸、香柏油、二甲苯，无菌牙签等。（三）革兰氏染色液①草酸铵结晶紫染色液②革氏碘液③95%乙醇④0.5%番红染液四.革兰氏染色的过程–制片1、取干净的载玻片，左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约0.5-1cm的均匀薄膜。若从斜面或平板上取菌，用无菌接种环取少量菌体，涂在预先滴有一小滴无菌水的载玻片上，使其薄而均匀。革兰氏染色的过程–染色2.初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3.媒染：先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。4.脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约20－30秒，使流出的酒精不再有紫色为止，后立即用流水冲洗。5.复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。6.镜检：观察染色结果。注意事项（1）革兰氏染色注意载玻片要洁净，滴无菌水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不宜过厚；热固定温度不宜过高，（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态；水洗时不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，过大，以免涂片薄层脱落。（2）革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性