寄生蜂dna病毒研究进展

寄生蜂dna病毒研究进展

通常，dna病毒（pdv）是膜鸢尾细胞象（icontae）和茧蜂（broconidae）寄生虫中发现的一种独特病毒。根据形态结构、系统发育和寄主范围的差异,多分DNA病毒分为姬蜂病毒属Ichnovirus和茧蜂病毒属Bracovirus,同属于多分DNA病毒科(Polydnaviridae)。PDV的最大特点是其基因组由多个双链、闭环超螺旋DNA分子组成,并且具有特殊的生活史。现在已知PDV只在寄生蜂雌蜂的卵巢萼上皮细胞内进行复制,并在寄生蜂寄生过程中以原病毒(provirus)的方式垂直传播给后代。自Rotheram1967年从姬蜂中分离出第一个病毒粒子以来,PDV的结构与功能的研究倍受关注。越来越多的证据表明,PDV在寄生蜂成功寄生过程中起着不可替代的作用,是寄生蜂突破寄主免疫系统、调节寄主生长发育的重要因素。PDV所具有的共生物(mutualist)和病原体(pathogen)的双重功能,使之成为昆虫生理学及病毒学的一个热点。目前从细胞及分子水平探究PDV功能的研究在国际上进展很快,但尚未引起我国生物科学工作者足够的重视。本文将从PDV的特征,其与寄生蜂的相互关系,对鳞翅目寄主的生理影响等几方面进行综述,以期能促进我国有关方面的研究。1pdv功能1.1病毒粒子在核衣壳内的释放尽管目前只对50多种PDV进行了比较系统的研究,但估计世界上大约有3万多种内寄生蜂带有PDV。姬蜂PDV和茧蜂PDV的形态结构有很大差异。姬蜂病毒粒子呈梭形或椭圆形,大小为85nm×330nm,外被两层单位膜,内膜是在雌蜂萼上皮细胞核内形成并装配的外膜是病毒粒子以出芽的方式被释放入输卵管腔中时获得的一般在双层膜内只含有一个核衣壳,典型的代表如姬蜂Campoletissonorensis病毒(CsPDV)。茧蜂病毒粒子一般呈圆柱形,其长度变化很大,大小可由30nm×40nm到40nm×150nm,外被一层单位膜;在膜内可含有一个或多个核衣壳,病毒粒子以细胞裂解的方式被释放入雌蜂萼腔中。有些茧蜂PDV在核衣壳的一端具有很长的尾巴;代表种为黑腿绒茧蜂Cotesiamelanoscela病毒(CmPDV)。不同种的寄生蜂带有不同的多分DNA病毒,它们在形态上有差异,即使是同一属的病毒。1.2pdv基因组dna片段中的非等克分子性多分DNA病毒有一个共同特征,其基因组由多个分节段的共价闭合双链环状DNA分子组成,每一个节段代表基因组里的一个超螺旋形式。这种分节段的基因组在所有双链DNA病毒中是独一无二的。研究表明,PDV基因组一般以两种形式存在:一种是以线性的原病毒片段的形式整合于寄生蜂基因组上,另一种是以环状的游离于染色体外的病毒DNA片段(片段为2～28kb)存在。现在用遗传学和分子生物学的方法已证实,PDV基因组以原病毒DNA片段的形式在寄生蜂种群内垂直传播。不同种寄生蜂的PDV,其基因组DNA数目与大小均不相同,并且在同一种病毒中,不同的DNA片段并非以等摩尔的比例存在,有些DNA的相对丰度较高。PDV可能通过这种基因组节段的非等克分子性(nonequimolarity)来提高某些基因的拷贝数,使其编码的蛋白量相应增多。而且,在PDV基因组中,有些基因在不同的DNA分子片段上重复出现,有相互嵌套(nested)现象,这可能也是这些基因提高其表达量的方式之一。但目前对于该类病毒DNA相对丰度不同的真正原因还不清楚。PDV基因组DNA片段一般从小到大以字母顺序排列,已知的PDV基因组片段由小于10个到大于28个不等的DNA片段组成。PDV的基因组大小估计在75～250kb之间,由于嵌套、共迁移(comigration)及同源性DNA片段的存在,使得病毒基因组大小的测量变得复杂、准确性降低[13～15]。1.3病毒基因组在体内的表达PDV的生活周期包含两个方面:复制(replication)和传递(transmission)。研究表明,PDV的复制仅限于雌蜂的卵巢萼上皮细胞内,在寄生蜂的其它组织和被寄生的寄主体内未发现有病毒的复制迹象。复制一般从寄生蜂蛹发育时开始,并且在整个雌蜂成虫期都持续进行。在变态过程中,蜕皮激素含量的增加可激发病毒DNA的复制。目前已知,该病毒的复制以持久整合的线性DNA为模板,但对此线性DNA复制的调控目前尚在研究之中。有一种可能是DNA在原位(即染色体上)复制,随后通过同源重组产生环状病毒DNA。姬蜂Campoletissonorensis的PDV(CsPDV)基因组中有一个540bp的重复序列可能在此过程中起作用。同时Savary等报道茧蜂Cotesiacongregata的PDV在复制之前进行病毒基因组的剪切(excision),剪切后的基因组重新连接。染色体外的环状病毒DNA不作为复制的模板,它们在决定PDV基因组的组成中不起任何作用,但在鳞翅目寄主昆虫体内具有转录活性。目前还没有发现PDV基因组在鳞翅目寄主体内有整合的现象。PDV进入鳞翅目寄主体内后病毒基因就开始表达,但是基因组不再进行复制。单个的病毒DNA分子可能有三种表达形式,一种是只在寄生蜂体内表达,一种是只在寄主体内表达,也可能在两者中都表达目前研究的最多的是在寄主中的表达情况随寄生蜂产卵进入寄主后,侵染寄主的许多组织,但主要攻击其血细胞。在一些茧蜂病毒属中PDV基因在寄主体内只瞬间表达,但在姬蜂及其它一些茧蜂病毒中,PDV基因却长期表达。CsPDV中长度为540bp的重复序列,在某些场合被组织特异性调控。对于PDV基因组在寄生蜂及其寄主体内表达调控机理的研究,也将为多分DNA病毒的起源与进化提供有力依据。但现在还没有发现病毒基因有一个级联放大过程,来增加病毒基因的表达水平。在CsPDV中具有一个富含半胱氨酸基序(cys-motif)的基因家族,CsPDV可能通过高效表达含有半胱氨酸基序的蛋白来调节寄主的生理反应。Webb等在最近的研究中发现,PDV的表达水平似乎是由顺式作用调节元件(cis-actingregulatoryelements)和基因拷贝数决定的。利用鳞翅目寄主系统研究发现,PDV在寄主体内的基因表达产物,对寄生蜂在寄主体内成功寄生起重要的作用。2pdv基因组与寄生蜂染色体dna的整合PDV与寄生蜂之间存在着互惠共生的关系。PDV在雌蜂卵巢萼上皮细胞内进行复制,当病毒粒子在萼细胞内发育成熟后,就被释放到萼腔里与其它物质一起组成萼液(calyx-fluid),所以萼液中包含有许多病毒颗粒。当寄生蜂产卵时,萼液随卵被一起注入鳞翅目寄主体内。萼液中的PDV对寄生蜂卵在寄主体内正常发育起重要的生理作用,其主要功能是抑制寄主的包囊反应,使寄生蜂免遭寄主免疫系统的攻击。PDV与其宿主寄生蜂在遗传上有着特殊的关系,PDV基因组可被线性整合于寄生蜂染色体DNA中。研究发现,C.sonorensis雌雄蜂体内均有两种形式的病毒DNA,但是未发现病毒在雄峰体内进行复制,在整合的病毒基因组中,节段B两端有短的同向重复序列,此重复序列与寄生蜂的DNA序列在结构上是复合体。整合的病毒DNA由于在寄生蜂雌雄个体内均存在,使得病毒在寄生蜂种群内垂直传播成为可能,同时也为PDV与寄生蜂的共生现象在遗传学水平上得到证实。PDV基因组DNA被整合的现象将对寄生蜂种群及遗传分析起一定作用。通过比较PDV基因与寄生蜂线粒体和染色体DNA的进化速率,将有可能推测出这些病毒的进化是否快于或慢于携带它们的寄生蜂,为病毒的起源提供依据。同时,PDV也将作为一种有用的工具在构建寄生蜂系统发育树中起一定作用。3寄生蜂卵及幼蜂在克氏原螯虾体内的生理反应PDV随寄生蜂产卵进入鳞翅目寄主内后,对寄主产生很大的生理影响,包括:抑制寄主的免疫反应,抑制体重增长及延缓发育,抑制脂肪体内蛋白质的贮存,改变激素水平等,这些生理变化都有利于寄生蜂卵及幼蜂在寄主体内的正常发育。其中PDV对鳞翅目寄主的免疫抑制(immunosuppression)和发育影响最为重要。3.1pdv对主要任务的预防3.1.1cdv通过破坏调昆虫对入侵的大的异物,产生细胞免疫反应,主要由浆细胞(plasmatocytes)和颗粒细胞(granularcells)相互作用对异物形成包囊。鳞翅目昆虫对物的包囊反应(encapsulation)包括三个阶段:(a)识别;(b)血细胞粘附形成包囊(capsule);(c)封杀。寄主受PDV感染后,上述细胞免疫过程就不能正常进行。自1981年Edson等首次发现CsPDV对烟芽夜蛾Heliothisvirescens的细胞免疫具有抑制作用以来,从细胞和分子水平对这种免疫抑制机理的研究成为该领域研究的热点。PDV侵染血细胞后,首先引起血细胞行为的改变,细胞变圆,并丧失了粘附和展形(spreading)能力,使血细胞不能对蜂卵进行包囊反应,同时也引起血细胞数量的下降。离体实验中发现,当被CsPDV感染的烟芽夜蛾H.virescens幼虫的血浆与正常幼虫的血细胞一起培养时,这些血细胞的展形受到了影响。不过,由于PDV具有种属特异性,它们对寄主血细胞及其功能影响的方式不尽相同。如Microplitisdemolitor的PDV(MdPDV)进入寄主Pseudopluseaincludens后主要攻击颗粒细胞,诱导细胞凋亡(apoptosis),最终导致细胞死亡;而Cotesiarubecula的PDV通过破坏寄主血细胞的细胞骨架从而抑制包囊反应。PDV影响血细胞行为和功能的机理目前还不甚清楚,有人认为血细胞的粘附和展形是由受体调节的,而PDV则通过影响配体或受体本身而起作用。另外,PDV引起细胞骨架的重组或离子状态的改变都可影响细胞的展形和细胞凋亡。PDV对寄主的免疫抑制作用可能是瞬间的,也可能是永久的。PDV在寄主体内只表达不复制,因而对PDV的免疫抑制机理的研究集中在对PDV基因产物的检测上。现在已分离到了一些PDV的基因表达产物,并对其功能作了初步的研究。CsPDV的一个VHv1.1基因,其编码的产物是个含有半胱氨酸区域的糖蛋白,分子量为30kD,该蛋白粘附在寄主血细胞上,破坏细胞骨架。同时,用杆状病毒作载体表达的VHv1.1基因产物可减弱寄主对洗去萼液的蜂卵的包囊反应。绒茧蜂C.rubeculaPDV的CrV1基因产物可破坏血细胞的肌动蛋白骨架。此外,PDV基因在寄主中的转录和表达也为PDV的免疫抑制作用提供了直接的证据。C.kariyai2.1kbPDV编码的mRNA在寄生2h后在寄主血细胞中进行表达,抑制寄主免疫反应。Strand等也从被寄生的P.includens的血细胞中检测到了两个MdPDV的mRNA,这两个mRNA都富含半胱氨酸基序,并且在MdPDV感染的血细胞cDNA文库中也分离到了该mRNA相应的cDNA,同时也显示PDV可对血细胞直接产生作用。对PDV基因表达及产物功能的研究对于深入揭示PDV破坏寄主细胞免疫的机制是至关重要的,这也是将来该领域研究的趋向。3.1.2cspdv与相关蛋白的活性体液免疫可认为是血淋巴的免疫反应,它并不需要血细胞的直接参与。昆虫一般具有三种体液免疫方式:防卫分子的束缚(如昆虫凝集素lectins),防御性黑化(melanization)以及诱导抗菌肽的产生。鳞翅目幼虫被寄生后,血淋巴的一些性状发生了改变,其中主要的变化包括血淋巴的粘性降低,酚氧化酶的活性受到了抑制以及新的多肽的出现[36,47～49]。这些变化大多是由PDV引起的。血淋巴的黑化是体液免疫的主要机制之一。黑化的过程由酚氧化酶(phenoloxidase,PO)参与,PO催化酪氨酸生成多巴,多巴转化成多巴胺后形成黑色素,黑色素对寄生物和病原物都有毒害作用。抑制酚氧化酶的活性,将导致抑制寄主对包囊的黑化作用。CsPDV感染烟草夜蛾9～12h后,其血淋巴暴露于空气中后黑化反应受到了很大抑制,这种变化是由单酚氧化酶的活性减弱引起的,同时,与寄主血淋巴中多巴色素异构酶及多巴脱羧酶(DOPAdecarboxylase,DDC)的活性的下降也有关。杂交结果显示,CsPDV感染后DDC在mRNA的水平上未发生变化,此酶的活性下降暗示着DDC的合成有可能在转录后水平上受到了影响。PDV对黑化的抑制也可能与黑色素形成过程中底物浓度的变化有关。寄生可影响寄主体内抗菌肽的合成情况。CsPDV在被注射入寄主H.virescens、Helicoverpazea、Trichopluseani和非寄主M.sexta中后,在寄主中的天蚕素(cecropin)和溶菌酶(lysozyme)活性显著下降,但在非寄主中并无影响。随后的研究发现寄主血浆中溶菌酶活性的降低在转录水平上并未受影响,很可能在转录后水平上影响了合成。被寄生的鳞翅目幼虫与正常幼虫相比,前者更易受病原物的感染,这可能也与PDV有关。当CsPDV被注射入寄主H.zea幼虫中后,此幼虫更易受Autographacalifornica核型多角体病毒的感染。寄生不仅影响了寄主的免疫系统,而且诱导寄主血淋巴中合成新的蛋白质。M.sexta被寄生后能引发早期寄生特异性蛋白(earlyparasitism-specificproteins,EPs)的表达,现在已知一个EP蛋白(EP1)是PDV的基因产物。在CsPDV感染的幼虫血淋巴中也分离到了一个50～55kD的寄生特异性蛋白,此蛋白可抑制寄主贮存蛋白的合成。这些寄生特异性蛋白与寄主免疫系统的影响有着紧密的联系,它们有可能是PDV的基因产物,也有可能来自于发育中的幼蜂,目前它们在调节寄主免疫系统中的功能还不是很清楚。3.2cspdv通过药物代谢和调节正常克氏原螯虾幼蜂中芳基蛋白、糖代谢,能降低蜕皮激素的释放内寄生蜂要在寄主体内正常发育,除了要克服寄主免疫系统的攻击外,还必须适应寄主体内的生理环境。PDV可通过许多途径来影响寄主的发育,包括抑制寄主的取食和生长,引起寄主的滞育,改变寄主的代谢使之有利于内寄生蜂卵和幼蜂的发育等,其中主要的影响是对寄主内分泌的调节及对寄主贮存蛋白合成的影响。PDV对寄主激素的调节是通过增加寄主保幼激素(JH)的滴度或降低蜕皮激素(MH)的水平来实现的。前者通过降低保幼激素酯酶(JHE)的活性来实现,后者则通过抑制促前胸腺激素(PTTH)的释放或直接影响前胸腺的功能来实现。CsPDV在被注入寄主H.virescens体内后,能引起该幼虫前胸腺的退化,从而降低蜕皮激素的滴度。姬蜂C.sonorensis及绒茧蜂Apanteleskariyai的萼液都能抑制寄主幼虫体内蜕皮甾酮的含量,延长末龄幼虫的历期,使之不能化蛹。PDV感染寄主后,还可引起寄主脂肪体内贮存蛋白含量的减少。烟芽夜蛾幼虫被寄生后,CsPDV的基因产物会引起血淋巴中芳基蛋白(arylphorin)合成受阻。芳基蛋白是昆虫血淋巴中一个高分子量的贮存蛋白,该蛋白的表达受昆虫生长发育的调节。CsPDV感染后引起寄主arylphorin的合成减少,其原因可能是幼蜂在发育过程中消耗了合成这些蛋白所需的氨基酸所致。粘虫P.separata被绒茧蜂A.kariyai寄生后,其脂肪体组织内不能积累很多贮存蛋白颗粒。进一步研究发现,CsPDV是在转录水平上影响寄主贮存蛋白的合成。另外,Hayakawa等发现C.kariyai的PDV被注射入寄主体内后,PDV可激发寄主产生生长阻抑肽(growth-blockingpeptide,GBP),GBP可抑制寄主血淋巴中保幼激素酯酶(JHE)的合成。寄生蜂寄生后,还可引起寄主体内营养水平的变化。如茧蜂M.croceipes的萼液能提高烟芽夜蛾H.virescens血淋巴中海藻糖的水平,这些海藻糖可被发育中的M.croceipes幼虫所吸收。PDV对寄主生长发育的调节,最终都将有利于寄生蜂在寄主体内的生长发育4免疫保护蛋白寄生蜂在寄生过程中,除了PDV外,还有其它因子也伴随卵被注入寄主体内,与PDV协同起作用,但在不同的寄生蜂-寄主系统中,其作用方式有差异[68～71]。这些因子包括:卵巢蛋白(ovarianproteins),畸形细胞(teratocyte)及蜂毒(venom)等。雌蜂生殖道中含有大量的卵巢蛋白,在姬蜂C.sonorensis中,卵巢蛋白与PDV编码的富含半胱氨酸的蛋白共同抑制寄主对蜂卵的包囊反应,该卵巢蛋白在寄生后4天内都可以在寄主血淋巴中被检测到,但在寄生后24～48h内失去抑制包囊反应的能力。在茧蜂Cotesiarubecula的萼液中也分离到一个结构上与病毒蛋白相似的萼液蛋白,此蛋白在PDV抑制寄主免疫系统前提供被动的免疫保护(passiveimmunoevasi