不同抗原修复法对免疫组织化学法检测子宫内膜病变中的h16和cyclind

不同抗原修复法对免疫组织化学法检测子宫内膜病变中的h16和cyclind

抗修复技术广泛应用于免疫组织化学的检测。修复方法的选择直接影响染色结果的真实性和准确性。这已有许多文献报道,但存在很大争议。例如,一种抗体不同克隆号可有不同的最佳修复方法。本文对2种修复液及不同的抗原修复法对p16和cyclinD1特异性抗体在子宫颈鳞状上皮病变组织的表达结果的影响进行比较,探讨最佳抗原修复方法,现介绍如下。1细胞聚合酶pa1.4方法将45例蜡块每例连续切片8张,其中p16抗体4张,cyclinD1抗体4张,常规脱蜡至蒸馏水,分别用A、B、C、D4种方法修复(见表1),自然冷却,IHC方法采用MaxVisionTM2二步法,3%H2O2处理15分钟特异性一抗37℃1小时,MaxVisionTM2试剂室温15分钟,DAB显色,苏木精复染。1.5评价标准采用双盲法由2位病理医师评价染色结果,p16参照Fromowitz方法［1］:在高倍镜下核内表达(1)无着色为0,淡黄色为1,棕黄色为2,棕褐色为3;(2)阳性范围:<5%为0,5%~25%为1,26%~50%为2,51%~75%为3,>75%为4。两者结果相加<2为阴性(-),2~3为弱阳性(+),4~5为中度阳性(++),6~7为强阳性(+++)。cyclinD1以阳性细胞定位准确、阳性信号强而背景清晰为最佳修复方法。1.6统计学分析采用SPSS17.0统计学软件,数据分析采用Wilcoxon非参数检验。2不同抗原修复法对调节性参数的影响2.1不同抗原修复法对子宫颈鳞状上皮组织中cyclinD1表达检测结果的影响组织切片用2种抗原修复液修复后,cyclinD1表达的阳性范围差别不大,都表达在子宫颈基底细胞核,少数子宫颈柱状上皮细胞也有表达,在子宫颈各级病变靠近基底细胞区域散在表达。但用EDTA液在表达强度上较柠檬酸盐缓冲液(citratebuffer,CB)明显,B组最强,数量有所增加,背景染色深,胞质普遍着色。A组:阳性信号稍减弱,颜色亮丽,对比明显,偶尔出现胞质着色,见图1。2.2不同抗原修复法对子宫颈病变中p16表达检测结果的影响组织切片用EDTA液和CB液高压修复后(B组和C组),用EDTA液者p16阳性信号CINⅠ级为(++)或(+++),CINⅡ级多数表达(+++)、少数为(++);用CB液者CINⅠ级阳性信号(+)、偶尔为(++),CINⅡ级多数为(++)、少数(+++)。B组与C组CINⅠ级(P=0.001,图2B、2C)、CINⅡ级(P=0.028)的p16阳性信号比较差异均有统计学意义,但随CIN病变发展阳性表达信号差异逐渐缩小,在CINⅢ级两组都表达(+++)。同种修复液不同方法(A组和B组,图2A、2B;C组和D组,图2C、2D)下p16的阳性表达结果差异无统计学意义(P>0.05)(详见表2)。切片用CB液修复时,p16在子宫颈病变中的表达比较符合病情演变过程。3问题的提出和修复以热处理来修复抗原是免疫组织化学染色中常用的手段,目的是暴露经甲醛固定引起氨基酸之间产生各种交联而封闭的抗原决定簇,以增强抗体的敏感性。目前国内尚未制定免疫组织化学统一标准。因此,不少研究者纷纷采用不同方法去暴露被封闭的抗原决定簇,有关这方面报道屡见不鲜［2］。p16是一种重要的抑癌基因,广泛应用于子宫颈鳞状上皮病变的研究,CIN的早诊早治是现阶段预防子宫颈癌的主要手段,但CIN并非单向的病理生理学发展过程,不同程度的CIN进展成为浸润癌的风险率不同,应该采用不同的临床处理方式［3-4］。p16蛋白的阳性正确表达直接影响临床治疗,组织切片用EDTA液修复p16阳性表达明显增强,即使CINⅠ级阳性强度在(++)或(++)以上(表2)。孙静阳等［4］报道p16能否区分CIN分级尚有争论,但在CIN表达中存在分层现象。王繁等［1］报道p16参与子宫颈病变的演进过程,这与本实验方法C、D组阳性结果相类似,较客观反映CIN病变的发展过程。当然,也要合理掌握修复时间,修复时间过长阳性强度反而减弱(图2),可能为长时间高温高压造成抗原成分破坏所致。cyclinD1为细胞周期中G1期进入S期的一个重要调控因子,主要应用于套细胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma)的诊断,在子宫颈病变方面研究甚少。组织切片经CB液和EDTA液修复,cyclinD1在子宫颈鳞状上皮的表达阳性范围相差不十分明显,但在视觉上EDTA液比CB液表达强度明显,基本是棕褐色颗粒,EDTA高压法普遍出现胞质着色,改用A法效果明显改善,阳性细胞表达强度稍减弱,背景清晰,对比明显。延长CB液修复时间,阳性细胞表达减弱(图1),有些正常基底细胞不表达。笔者认为cyclinD1应选EDTA液电磁炉煮沸法,这与试剂公司推荐使用修复方法一致。本研究中没有证据证明cyclinD1阳性表达与子宫颈病变的发展存在相关性,这与王繁等［1］报道cyclinD1表达的递增与疾病的进展情况一致的意见相左。不恰当的抗原修复法可导致假阳性或假阴性结果,EDTA修复液(pH9.0)阳性强度大于CB修复液(pH6.0),切片经EDTA液修复p16在子宫颈病变的表达反而会误导诊断医师的判断。每一种抗体由于试剂厂家、型号、实验室的条件不同阳性表达结果会存在差异,每种抗体经抗原修复后是否正确,是否真实可靠的表达阳性信号,要根据基础研究信息,了解该新抗体与其对应抗原的特异性及其在特定细胞内的定位分布,还要结合组织形态学分析该抗体阳性染色在特定细胞内的分布是否符合临床观察结果,针对每种抗体怎样合理选择抗原修复方法是一个在实际操作过程中不断学习、积累和完善的过程。参考文献:1.1材料收集本院妇科门诊2011年6月-2012年11月门诊活检标本45例,其中子宫颈炎10例,尖锐湿疣5例,子宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级10例,子宫颈CINⅡ级10例,子宫颈CINⅢ级10例。1.2试剂即用型单抗p16,克隆号:6H12,编号:MAB-0223;即用型单抗cyclinD1,克隆号:SP4,