第六章 外源性化学物的一般毒性作用

第六章一般毒性作用及其试验与评价方法一般毒作用（generaltoxicity）：指外源化学物在一定的剂量范围内，经一定的接触时间按照一定的接触方式，对生物有机体产生的综合毒性效应。又称为基本毒性（basictoxicity）。根据接触毒物的时间长短可分为：急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性。相应的试验称为急性毒性试验、亚慢性毒性试验和慢性毒性试验。一般毒性测试污染物理化特性毒性大小和特征蓄积和耐受特性了解靶部位和指标确定阈和阈下剂量急性毒性试验亚急性毒性试验亚慢性毒性试验慢性毒性试验蓄积毒性试验（≤3个月）（3—6个月）（6个月到终身）急性致死试验非急性致死试验外源化学物一般毒性试验项目第一节急性毒性作用及其实验与评价方法一、基本概念急性毒性（acutetoxicity）——是指机体一次接触或24小时内多次接触外源化学物之后所引起的快速剧烈的毒效应。包括一般行为、外观及形态改变，甚至死亡。急性毒性试验（acutetest）——是指一次给予或24小时内多次给予受试物后，短时间内动物所产生的毒性反应。二、急性毒性试验目的1、确定LD50，根据LD50值进行急性毒性分级。2、阐明外源化学物相对毒性、作用方式和特殊毒性表现，得到剂量-效应（反应）关系曲线，了解其临床症状、生理生化、病理改变及可能的靶器官。3、确定外源化学物入侵机体的途径，研究其在机体内的生物转运、转化过程。4、研究受试物急性中毒的预防和急救治疗措施。三、急性毒性试验方法（一）实验动物的选择和要求1、动物种属选择选择对化学物毒性反应与人相似的动物，要求试验操作方便、易于饲养管理、易于获得且价格低廉的动物。一般选择两种或两种以上的试验动物，最好一种为啮齿动物，另一种为非啮齿类动物，分别求出其急性毒性参数。2、动物品系、性别及年龄的选择为了避免试验结果存在品系差异，最好选择纯种动物。性别选择以试验目的而定。年龄一般选用初成年动物。大鼠180～240g小鼠18～25g、家兔2～2.5kg、豚鼠200～250g、狗10～15kg。实验动物应进行检疫，检疫期一般为5～7天，剔除异常的动物。染毒途径应模拟人可能的接触途径。经口灌胃染毒，要求试验前要对动物禁食。大鼠应过夜禁食，小鼠应禁食4小时。3、各剂量组动物数及实验动物分组急性毒性试验中每个剂量组的动物数，小鼠不少于10只，大鼠6～8只，家兔4～6只。实验动物分组采用随机分组。4、实验动物喂养环境试验动物喂养室室温控制在（22±3）℃，家兔可控制在（20±3）℃，无贼风。每笼动物数以不干扰动物个体活动及不影响试验观察为度，必要时单笼喂养。人工昼夜——早6点至晚6点进行12小时光照，其余时间黑暗，常规饲料，自由饮水。2、实验动物染毒方法（1）经口（胃肠道）接触灌胃饲喂吞咽胶囊（2）经呼吸道接触：静式、动式（3）经皮肤接触（4）经注射途径染毒3、剂量组及剂量分组通过预试验测定受试物LD100和LD0的范围，才能正确地设计正式试验各组的剂量。（1）预实验的剂量设计等比剂量设计：r=4，组距=lg4=0.6目的：得到死亡率在10%~90%的致死剂量范围3X3法：r=10序贯法：设计一系列等比剂量，将动物一只一只序贯进行求LD100和LD0的范围方法如下：小白鼠随机分成3～4组，每组3只，各剂量组分别是1、10、100、1000mg/kg，灌胃或腹腔注射染毒。若某组死亡率为3/3，其前一组死亡率为2/3或1/3，则该组剂量就是100%致死剂量。同样的方法找出LD0

。如果死亡率没有获得上述的理想剂量范围，则可依据实际情况将剂量提高或降低一个数量级继续进行预试验，直至找出符合要求的最高和最低剂量范围为止。正式试验按等比级数（1.2～1.5）在最高和最低剂量范围内插上3～5个剂量组进行试验。（2）正式试验的剂量设计计算组距或公比：γ:：各组公比数n：剂量组数a：最低致死量b：最高致死量logLD50=Xm－d(Σp－0.5)Xm：最大剂量的对数d：相邻剂量比值的对数Σp：各组死亡率总和例如——每组各小白鼠给予同一种剂量，灌胃染毒，剂量范围大约400～800mg/kg。以各组公比数计算每组染毒的剂量a=400mg/Kgaγ=400×1.2=480mg/Kgaγ2=400×1.22=576mg/Kgaγ3=400×1.23=691mg/Kgaγ4=400×1.24=829.44mg/Kg以此剂量作用于小白鼠，得出结果如下：组别剂量mg/Kg动物数死亡数死亡率p存活率q140010001.024801020.20.835761050.50.54691.21070.70.35829.4410101.00计算logLD50=Xm－d(Σp－0.5)Xm：最大剂量的对数d：相邻剂量比值的对数Σp：各组死亡率总和Xm=log829.44=2.9188d=log1.2=0.0792Σp=0+0.2+0.588+0.7+1.0=2.4代入公式：logLD50=2.9188－0.0792×（2.4－0.5）=2.76832查反对数得出LD50=log-12.76832=586.57mg/Kg求logLD50标准误“S”LD50的95%可信限=log-1(logLD50±1.96×SlogLD50)=log-1(2.76832±1.96×0.0197)=536.6857－567.0318剂量组的设置应依据预试验结果而定，一般最高最低两剂量组间差别较大者，则组数即每组动物数应较多。最高最低剂量相差2～4倍，至少设3～4组；相差4～9倍者，至少应设4～5组；相差10倍以上者，至少应设6个组。通常最高最低剂量相差多在10倍以内，以设置5-7组为宜。（六）试验周期急性毒性试验除了计算受试物LD50外，还需要通过观察实验动物的中毒症状判断受试物的毒作用性质，推断中毒的靶器官。试验周期以2周为宜。（七）观察指标

1、LD502、症状观察

3、病理学检查

4、其他指标观察死亡与死亡时间体重变化四、急性毒性的分级与评价为评价外源化学物急性毒性的强弱及对人类的潜在危害程度，国际上提出了外源化学物的急性毒性分级标准用以对急性毒性进行评价。我国食品毒理学中外源化学物经口毒性分级级别大鼠口服LD50mg/Kg相当于人的致死量相当于体重70Kg人致死剂量mg/Kg克/人6级，极毒＜1稍尝0.05稍尝，＜7滴5级，剧毒1～50500～40000.57滴至1茶匙4级，中等毒51～5004000～3000051茶匙至35克3级，低毒501～500030000～2500005035～350克2级，实际无毒5001500000500350～1050克1级，无毒＞15000＞5000002500＞1050克（引自《食品安全性毒理学评价程序和方法》，GB15193.1～15193.19-94）外源化学物急性毒性分级(WHO)毒性分级大鼠一次经口LD50(mg/kg)6只大鼠吸入4小时死亡2～4只的浓度(ppm)(mg/kg)兔经皮LD50(mg/kg)对人可能致死剂量g/kg(g/60kg)剧毒＜1＜10＜5＜0.050.1高毒1～10～5～0.05～3中等毒50～100～44～0.5～30低毒500～1000～350～5～250微毒5000～10000～2180～＞15＞1000结果判定：1.LD50或7天喂养试验最小有作用量小于人的可能摄入量的10倍者，则放弃该受试物用于食品，不再继续其他毒理学试验。2.如大于10倍，可进入下阶段试验，为慎重起见，试验应进行重复试验，或用另一种方法进行验证。第二节蓄积毒性作用及其评价蓄积作用（accumulation）若一种外源化学物反复多次进入机体而且其前次进入剂量尚未完全消除，则这一化学物在体内的总量将不断增加并贮留，此现象称化学物的蓄积作用。蓄积性的存在，无论是物质蓄积还是功能蓄积，都是长期接触毒物发生慢性毒作用的重要条件。因此：理论上应从蓄积试验作为前提条件，以决定是否还需要进一步做慢性毒性蓄积试验。一、基本概念二、蓄积毒性试验方法及其评价蓄积毒性试验是检测化学物蓄积性大小的试验，并可为慢性毒性试验做准备。常用的试验方法有蓄积系数法及生物半衰期法。（一）蓄积系数法蓄积系数(K)是指多次染毒使半数动物出现效应的总剂量(ED50（n）)与1次染毒的半效量(ED50（1）)之比值，即：试验常以死亡为观察的效应，此时：如果受试物在体内物质蓄积或功能蓄积是完全的，则多次给予的总剂量与一次给予同等剂量的毒性相当，此时ED50（n）=ED50（1），即：K=1。若蓄积不完全则毒效应程度上有差别，一般根据K对蓄积性进行估计。K＜1：高度蓄积；1≤K＜3：明显蓄积；3≤K＜5：中等蓄积；K≥5：轻度蓄积。K越大，蓄积毒性越弱。反之亦然。1、固定剂量法固定剂量法为Kagan和Stankevic(1964)提出，它采用先测出1次染毒的LD50(即为LD50(1))，然后对另一组动物每天给予l/10LD50(偶尔有用1/20LD50)直至半数动物死亡为止，此时的总剂量即为LD50

(n)。如果到第50天死亡动物仍末达半数，则停止试验，因为此时总剂量已达5个LD50(指每天l/10LD50(1))时表示仅有轻度蓄积作用。2、递增剂量法