第四章 微生物的代谢调控与代谢

第四章微生物的代谢调控与代谢工程

第一节微生物代谢的自我调节第二节微生物的代谢调控第三节提高代谢产物产量的方法第四节代谢工程第一节

微生物代谢的自我调节微生物代谢是受到高度调节的，如下事实可以说明

1）微生物生长在含单一有机化合物为能源的合成培养基中，所有大分子单体（如氨基酸）的合成速率同大分子（如蛋白质）的合成速率协调一致，不会浪费能量去合成那些他们用不着的东西。

2）任何一种单体的合成，如能从外源获得并能进入细胞内，单体的合成自动停止，参与这些单体生成的酶的合成也会停止；

3）微生物只有在有某些有机基质（如乳糖）存在时，才会合成异化这些基质的酶；

4）如存在两种有机基质，微生物会先合成那些能异化更易利用的基质的酶，待易利用的基质耗竭才开始诱导分解较难利用的基质的酶；5）养分影响生长速率，从而相应改变细胞大分子的组成（如RNA含量）一、酶活性调节

共价修饰变(别)构效应酶活性的调节方式缔合与解离竞争性抑制

1、共价修饰

酶活性调节（continued）指蛋白质分子中的一个或多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或解开，使其活性改变的作用。化学基团：磷酸基、腺苷酰基、甲基、乙基等蛋白质的共价结合部位一般为丝氨酸残基的-CH2OH共价修饰分可逆和不可逆两种1）可逆共价修饰有些酶存在活性和非活性两种状态，它们可以通过另一种酶的催化作用共价修饰而互相转换。如:糖原磷酸化酶

通过激酶和磷酸酯酶来调节活性

磷酸化形式有活性去磷酸化形式无活性酶可逆共价修饰的意义：1）因酶构型的转换是由酶催化的，故可在很短的时间内经信号启动，触发生成大量有活性的酶；2）这种修饰作用可更易控制酶的活性以响应代谢环境的变化。

这一系统具有能随时响应的特性，因而经常在活化与钝化状态之间来回变换。

需消耗能量，但只占细胞整个能量消耗的一小部分2）不可逆共价修饰

典型的例子是酶原激活——无活性的酶原被相应的蛋白酶作用，切去一小段肽链而被激活(胰蛋白酶原的活化靠肠肽酶从其N-端切去一个己肽Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)酶原变为酶是不可逆的信号放大酶完成使命后便被降解，关闭酶活性2、变构控制

变构或别构(allosterism)效应是指一种小分子物质与一种蛋白质分子发生可逆的相互作用，导致这种蛋白质的构象发生改变，从而改变这种蛋白质与第三种分子的相互作用。

变构蛋白是表现变构效应的蛋白，如阻遏蛋白

具有变构作用的酶称作变构酶变构调节机制：1）变构酶具有一个以上的结合位点，除了结合底物的活性中心外，在同一分子内还有一些分立的效应物结合位点（副位点）；2）主位点和副位点可同时被占据；3）副位点可结合不同的效应物，产生不同的效应；4）效应物在副位点上的结合可随后引起蛋白质分子构象的变化，从而影响酶活性中心的催化活性；5）变构效应是反馈控制的理论基础，是调节代谢的有效方法。3、缔合与解离

酶活性调节（continued）

能进行这种转变的蛋白质由多个亚基组成；

蛋白质活化与钝化是通过亚基缔合与解离实现的；4、竞争性抑制

酶活性调节（continued）

一些蛋白质的生物活性受代谢物的竞争性抑制如需要氧化性NAD+的反应可能被还原型NADH的竞争抑制；需ATP的反应可能受ADP或AMP的竞争型抑制；有些酶受反应过程产物的竞争性抑制二、酶合成的调节

酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制，这是一种在基因水平上（在原核生物中主要在转录水平上）的代谢调节。凡是能促进酶合成的调节称为诱导；而能阻碍酶合成的调节称为阻遏。

同调节酶的活性的反馈抑制等相比，通过调节酶的合成而实现代谢调节的方式是一类较间接而缓慢的调节方式；其优点是通过阻止酶的过量合成，有利于节约生物合成的原料和能量。一）酶合成调节的类型

诱导末端产物阻遏阻遏分解代谢产物阻遏1、酶合成的诱导（induction）组成酶不依赖于酶底物或类似物的存在而合成如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶诱导酶依赖于某种底物或底物的结构类似物的存在而合成如大肠杆菌乳糖利用酶

诱导剂可以是诱导酶的底物，也可是底物的结构类似物如：乳糖是大肠杆菌β-半乳糖苷酶合成的诱导剂，也是此酶的底物[实际上乳糖不是真正的诱导物，它必须先转化为别构乳糖才能起诱导剂的作用]

诱导剂也可以不是该酶的作用底物如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）是β-半乳糖苷酶合成的极佳诱导剂，但不是作用底物；

酶的作用底物不一定有诱导作用如对硝基苯-α-L-阿拉伯糖苷是β-半乳糖苷酶的底物，但不能诱导该酶的合成。酶的诱导可分两种：1）同时诱导当诱导物加入后，同时或几乎同时诱导几种酶的合成；主要存在于短的代谢途径中。如将乳糖加入到E.coli培养基后，可同时诱导出β-半乳糖苷透性酶、β-半乳糖苷酶、半乳糖苷转乙酰基酶；不管诱导强度如何，所以这三种蛋白以同一比例合成。（因为三者的基因组成同一操纵子）2）顺序诱导先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。2、酶合成的阻遏(repression)

末端产物阻遏(end-productrepression)

分解代谢物阻遏(cataboliterepression)末端产物阻遏(end-product

repression)

1指由某代谢途径末端产物过量积累而引起的阻遏。

2对直线式途径来说，末端产物阻遏的情况较简单，即产物作用于代谢途径中的各种关键酶，使之合成受阻；对于分支代谢途径而言，情况较复杂，每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。代谢途径分支点以前的“公共酶”仅受所有分支途径末端产物的阻遏（多价阻遏作用）。

3末端产物阻遏在代谢调节中有重要作用，保证细胞内各种物质维持适当的浓度；普遍存在于氨基酸核苷酸生物合成途径中。分解代谢物阻遏(catabolite

repression)

——是指两种碳源（或氮源）分解底物同时存在时，细胞利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关分解酶合成的现象。or——当培养基中同时存在有多种可供利用的底物时，某些酶的合成往往被容易利用的底物所阻遏，这就是分解代谢阻遏。

最典型的例子是细胞通过最易利用的碳源（如葡萄糖）的分解产物来抑制一些酶的合成。

这个现象最早在青霉素的生产中发现，可快速利用的葡萄糖致使青霉素产量特别低，而缓慢利用的乳糖却能较好地生产青霉素。进一步的研究表明，乳糖并不是青霉素合成的特殊前体，它的价值仅在于缓慢利用。被快速利用的葡萄糖的分解产物阻遏了青霉素合成酶的合成。这种抑制青霉素合成及乳糖利用的现象，起初认为只有葡萄糖才会产生，故称为葡萄糖效应。把大肠杆菌培养在含有葡萄糖和乳糖的培养基中，可明显看到大肠杆菌经历了两个对数期。葡萄糖在第一个周期中被利用。在葡萄糖代谢初期，β-半乳糖苷酶和半乳糖苷透性酶的合成受阻遏，使乳糖不被利用。葡萄糖被消耗完后，乳糖代谢所需的酶开始合成，于是出现了利用乳糖的第二个生长周期。二）酶合成调节的分子机制

目前认为，由Monod和Jacob提出的操纵子假说能较好地解释酶合成的诱导和阻遏

启动基因(promoter)RNA聚合酶结合部位操纵子

(operon)操纵基因(operator)操纵基因位于启动基因和结构基因之间，能与阻遏物（一种调节蛋白）相结合，以此来决定结构基因的转录能否进行

结构基因(structuralgene)结构基因为一组功能相关的基因诱导型操纵子只有当存在诱导物时其转录水平才最高,并随之转译出诱导酶（inducibleoperon）负责基质分解如乳糖操纵子阻遏型操纵子只有当缺乏辅阻遏物时其转录频率才最高，即只有通过去阻遏作用才能启动所编码酶的合成（repressibleoperon）负责某些物质合成色氨酸操纵子

末端产物(反馈)阻遏机制:(以色氨酸操纵子

为例)

色氨酸操纵子的阻遏是对合成代谢酶类进行正调节的典例

E.coli色氨酸操纵子也由启动基因、操纵基因和结构基因（5个）三部分组成。5个结构基因分别编码色氨酸合成途径中的5种酶。调节基因(trpR)远离操纵基因，编码阻遏物蛋白；其为由4个亚基组成的四聚体；单独的四聚体不能和操纵基因(trpO)结合，只有先结合了色氨酸分子后改变了四聚体的分子构象才能与trpO结合。当细胞内色氨酸浓度高时，色氨酸与阻遏物蛋白结合，形成完全阻遏物，与操纵基因结合，阻止结构基因转录（色氨酸为辅阻遏物）。当细胞内色氨酸缺乏或不足时，则导致阻遏物脱离操纵基因，使操纵基因“开关”打开，结构基因的转录又可正常进行。三、分支生物合成途径的调节

1、同工酶（isoenzyme）调节某一分支途径中的第一步反应可由多种酶催化，但这些酶受不同的终产物的反馈调节.(酶的分子结构不同)DEYABCFGZ如：大肠杆菌的天门冬氨酸族氨基酸的合成途径中，有三个同工酶：天门冬氨酸激酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，分别受赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸的反馈调节2、协同反馈调节(concertedfeedbackregulation)

需有一种以上终产物的过量存在方有明显的效果单个终产物过量，不产生或只产生很小的影响

EDABCFG3、累加反馈调节(cumulativefeedbackregulation)每一种末端产物过量只能部分抑制或阻遏，总的效果是累加的

30%E

DABCF40%G

58%4、增效反馈调节(cooperativefeedbackregulation)代谢途径中任一末端产物过量时，仅部分抑制共同反应中第一个酶的活性，但两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各末端产物产生的抑制作用的总和。15%E

DABCF20%G90%5、顺序反馈调节(sequentialfeedbackregulation)

分支途径中几个末端产物抑制分支点后面第一个酶，使分支点产物积累，结果分支点产物又反馈抑制共同途径中的第一个酶，最后使整个代谢途径停止。

EFabcd1g1ABCDGHId2g2JK6、联合激活或抑制调节由一种生物合成的中间产物参与两个完全独立的、不交叉的合成途径的控制。这种中间体物质浓度的变化会影响这两个独立代谢途径的代谢速率。肠细菌氨甲酰磷酸合成酶的联合激活和抑制

抑制作用氨甲酰磷酸

N-乙酰谷氨酸谷氨酸鸟氨酸瓜氨酸精氨酸激活作用

CO2氨甲酰磷酸合成酶

NH4+氨甲酰磷酸

UMPCTP2ATP抑制作用

肠细菌中精氨酸和嘧啶核苷酸的合成途径是完全独立的，但它们有一共同的中间体——氨甲酰磷酸。

负责合成该中间体的酶——氨甲酰磷酸合成酶可以被嘧啶代谢途径的代谢物UMP反馈抑制，也可被精氨酸合成途径中的中间体鸟氨酸激活。四、能荷调节能荷（energycharge）——指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可为代谢反应供能的高能磷酸键的量度。能荷调节——指细胞通过改变ATP、ADP、AMP三者比例来调节其代谢活动，也称腺苷酸调节。能荷不仅调节形成ATP的分解代谢酶类（如磷酸果糖激酶、异柠檬酸脱氢酶、柠檬酸合成酶等）的活性，也调节利用ATP的生物合成酶类（如柠檬酸裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶等）的活性。第二节

微生物的代谢调控

对于生命过程来说，代谢反应的协调是必要的；

代谢反应的协调是通过细胞自身的代谢调控系统对细胞机能实行精细控制来达到的。

但是，在工业生产中却往往需要单一地积累某种产品，这些产品的量又经常是大大地超出了细胞正常生长和代谢所需的范围。因此，要达到过量积累某种产品的目的，提高生产效率，就必须使原有的调节系统失去控制，在保证微生物适当生存的条件下，建立起新的代谢方式，使微生物的代谢产物按照人们的意志积累。一、克服反馈抑制和反馈阻遏的调控

反馈抑制反馈调节反馈阻遏克服反馈调节，可从以下两方面着手：

降低末端产物浓度应用抗反馈突变株1、降低末端产物浓度1）营养缺陷型的利用营养缺陷型是指原菌株因基因突变致使合成途径中断，丧失了合成某种必须物质的能力，而必须在培养基中加入相应物质才能正常生长的突变菌株。营养缺陷型突变株的代谢流受阻，末端产物减少，解除了末端产物参与的反馈调节，可使代谢途径中的某一中间产物积累。利用营养缺陷型积累

直链代谢途径中间代谢产物

反馈抑制

EaEbEc缺陷

EdABCxDE

反馈阻遏若要积累C，首先要获得缺失酶c的营养缺陷型。

酶c缺失后，物质C便不再转变成物质D，不再合成物质E。

由于这种突变体已不能合成末端产物E，所以就解除了E对酶a和酶b的反馈调节。但是，完全不能合成产物E的突变体，因为不能利用E去进一步合成必须的细胞物质，所以无法正常生长。为了保证突变体的正常生长，培养时须提供低浓度的、不足以引起反馈调节的物质E。这样高浓度的中间产物C就能积累起来了。例如：利用枯草杆菌的精氨酸缺陷型生产瓜氨酸，利用大肠杆菌的赖氨酸缺陷型生产苏氨酸，都是这个道理。2）提高细胞渗透性

细胞内合成的发酵产物若要分泌到培养基中，必须经过细胞膜和细胞壁。如果产物不易分泌出细胞，而积累在细胞内，则会引起反馈调节。

改变细胞膜和细胞壁的通透性，使其有利于产物的分泌，也是降低末端产物浓度的一种途径。降低末端产物浓度(continued)2、抗反馈调节突变株