第二章 生物制药工艺学技术基础

第二章生物制药工艺技术基础

Basisofbiopharmaceuticaltechnology

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一、生物材料的选择：

1．生物活性物质存在部位：胞内、胞外、胞浆、质膜、器膜、周质

2．生物材料的采集与质控

（1）品种鉴定；（2）防止污染与感染；（3）选择富集目的物材料；（4）冷冻保存

第一节生物药物提取、分离、纯化技术基础2

二、生物活性物质物质常用的提取方法与优化

（一）几种常用提取方法

1．酸、碱、盐水溶液提取方法

2．表面活性剂提取方法与反胶束提取方法

3．有机溶剂提取

4.双水相萃取法

5．超临界萃取法

3（二）提取方法与优化

1.溶剂选择

2.选择添加剂①保护剂；②酶抑制剂

3.提取条件①温度；②pH；③盐浓度；④表面活性剂4三．浓缩与干燥1.浓缩方法：①盐析；②有机溶剂沉淀；③高分子脱水④超滤；⑤真空浓缩或薄膜浓缩；

562.干燥：①低温真空干燥；②喷雾干燥；③冷冻干燥

789四、分离纯化1.生化制药工艺中分离纯化特点:(1)生物材料组成复杂(2)目的物含量低(3)易变性、失活(4)分离方法有很大经验成分(5)步骤多，逐级分离102.分离纯化原理

(1)根据分子形状与分子大小(膜分离、凝胶过滤层析、超滤等)(2)根据电荷差异(离子交换层析)(3)根据分子极性与溶解度大小(疏水色谱、萃取分离技术、盐析、结晶技术等)(4)根据吸附特性(吸附分离技术)(5)根据生物配基特性(亲和层析)113.选择原则（1）粗品分离：大处理量,相对低分辨率盐析，分级沉淀，萃取，超滤（2）精制：高分辨率多种色谱层析法,亲和层析，HPLC，FPLC，电泳或等电聚焦12

第二节微生物制药工艺技术基础

一、菌种的选育与保藏1．自然选育依据自发突变原理，通过不断分离筛选，除去衰变菌落，选择高产菌，达到强化、复壮、稳定生产目的。方法：（1）平板划线法（2）稀释平板法132．诱变育种是指有意识地将生物体暴露于物理的、化学的一种或多种诱变因子，促使生物体发生突变，进而从突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。（1）出发菌株的选择①:稳定性;②:具备某种优良性状的菌株③:对诱变剂敏感;④:生理状态及生长时间（2）诱变处理:①化学诱变(烷化剂、核酸碱基类似物、抗生素)；②物理诱变(各种射线)；（3）筛选：①随机筛选；②半理性化筛选14突变株筛选一般进程如图所示

第三第四轮同第二轮153、现代菌种选育技术①：杂交育种②：原生质体融合③：基因工程技术

163．菌种保存（1）保存目的：防止退化（2）菌种退化检查方法（3）菌种退化防止方法①防止基因突变：如低温保藏②采用双重缺陷型③制作平行的菌种斜面，少传代④分离单菌落，自然筛选⑤选择培养条件17（4）菌种保藏方法：①斜面低温保存②液体石蜡封藏法③甘油冷冻法④冷冻干燥法⑤液氮保藏法18二、发酵工程技术基础

发酵工程：单细胞纯培养工业化过程，以产生大量目的物。

1．液体培养——深层发酵

2．固体培养——浅盘培养发酵设备：空压机、种子罐、发酵罐，蒸汽发生器、空气过滤器、离心机及多种参数控制与检测设备。

19图1L-Lys生产过程工艺设备图20第三节生物技术药物

制造技术基础21补充知识—PCR技术聚合酶链式反应简称PCR（PolymeraseChainReaction）：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断。又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。22基本原理

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR是一种体外DNA扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。23步骤

模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。2425引物：引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。常用的引物设计软件：Oligo6

；PrimerPremier5.0

26引物设计原则：1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。2.引物长度一般在15~30碱基之间。3.引物GC含量在40%~60%间，Tm值最好近72℃4.引物3′端要避开密码子的第3位。5.引物3′端不能选择A，最好选择T。6.碱基要随机分布。7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。8.5′端和中间G值应相对较高3′端较低9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。10.扩增产物的单链不能形成二级结构。27PCR反应系与反应条件

PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+标准的PCR反应体系：

10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ul28PCR反应特点PCR反应的特异性决定因素：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。2930探针是一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素（通常用磷-32）、萤光染料或者酶（如辣根过氧化物酶）标记成为探针。磷-32通常被掺入组成DNA的四种核苷酸之一的磷酸基团中，而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸（DNA或RNA）序列通过氢键紧密相连，随后，未被杂交的多余探针被洗去。最后，根据探针的种类，可进行放射自显影、萤光显微镜、酶联放大等方法来判断样品中是否，或者何位置含有被测序列（即与探针互补的序列）。31cDNA文库（cDNAlibrary）含一种生物体所有基因编码的cDNA分子的克隆群。以以特定的组织或细胞mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。32构建cDNA文库的作用：cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。

cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。33PCR的类别反向PCR：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组文库。34不对称PCR：目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：主要为测序制备ss-DNA，尤为用c-DNA经不对称PCR进行DNA序列分析是研究真核DNA外显子的好方法。

制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究35荧光定量PCR：通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。36多重PCR是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。37RT-PCR反转录·聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR）是将RNA的反转录（reversetranscription）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。3839原位PCR：原位聚合酶链式反应（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列40既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。41用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学42

一、重组DNA技术原理1．基因工程操作过程：

（1）获得目的基因；（2）构建DNA重组体；（3）将重组体导入宿主细胞；（4）工程菌的克隆与鉴定；（5）目的基因扩增与蛋白表达。

432．基因工程药物制造过程44二、基因工程主要操作技术1．目的基因的获得（1）cDNA文库纯化目的mRNA，逆转录成cDNA①mRNA的分离②cDNA第一链的合成③cDNA第二链的合成④cDNA与载体连接⑤转染或转化⑥筛选目的克隆45目的基因的获得：cDNA文库46（2）PCR法或逆转录PCR（RT-PCR）

典型PCR反应包括①模板变性94℃以上（1～2′）②退火50～55℃（1～2′）③延伸72℃（1～2′）在高温聚合酶作用下，以DNA单链为模板，由引物起始从5′→3′延伸。4748（3）化学合成法

在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。492．DNA重组体的构建根据宿主菌不同，选择基因载体（Vector）（1）E.coli质粒非表达型pBR322，表达型pUC，实用型pBV220，PET系统，λ噬菌体DNA作为载体，非表达型λgt10，表达型λgt11。（2）芽孢杆菌pUB110pE194和pC194（3）链霉菌pIJ101pSG5cDNA与载体连接方法①同聚尾连接法②人工接头连接法503．重组体的表达系统（1）原核表达系统①E.coli；②芽孢杆菌Bacillus；③链霉菌Streptomyces优点：易大量生产，成本低，周期短缺点：多为胞内表达、提取困难，易生成包涵体、含起始密码Met(AUG)，有内毒素毒性51（2）真核表达系统①酵母表达毕赤酵母（pichiapsatoris）受甲醇诱导优点：易培养无毒性，易高密度发酵（100g/L），高表达，成本低，产物可糖基化，有分泌表达。②动物细胞哺乳动物细胞——CHO（仓鼠细胞）昆虫细胞——家蚕细胞524．表达产物的纯化包涵体inclusionbodies:大部分是表达产物，（还有细胞蛋白和膜蛋白）一级结构正确、无活性，不溶于水，可用变溶剂SDS尿素，盐酸胍溶解，再稀释透析除去变性剂，使其复性。53

为防止或减少包涵体的形成常用方法：

（1）降低培养温度从37℃降到30℃可显著降低包含体形成率。（2）以硫氧还原蛋白为载体进行融合表达。硫氧还原蛋白是E.coil的一种同源蛋白，定位于粘附区，富含-SH,可保目的蛋白不发生分子错误折叠，是一种热稳定蛋白，表达产物聚集于粘附区，通过振扰提取使产物进入介质中，再酶解就得到目的蛋白。54三、酶工程制药技术基础1、酶工程(enzymeengineering)的研究内容（1）酶的发现、分离纯化与生产应用。（2）酶与细胞的固定化技术与酶反应器。（3）生物酶工程：以基因工程技术和蛋白质工程技术研究酶工程。（4）抗体酶、模拟酶