第七章-现代生物学

第七章

现代生物学技术在蛋白质工程中的应用

传统技术：分离纯化技术，如层析技术、电泳技术；蛋白质鉴定技术，如免疫印迹技术、酶联免疫吸附测定（ELISA）新技术：对蛋白质进行分析鉴定的蛋白质芯片技术、蛋白指纹图谱技术；用于功能蛋白质筛选的表面展示技术

第一节表面展示技术运用DNA重组技术在噬菌体、细菌、真菌、病毒等微生物表面呈现外源蛋白或多肽，已在微生物学、分子生物学、疫苗学和生物技术等方面得到了广泛应用。概念表面展示技术是利用基因工程手段将外源基因或一组一定长度的随机寡核苷酸片段克隆到特定的表达载体中，使其表达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌体表面。一、噬菌体展示技术

噬菌体展示技术（phagedisplaytechniques，PDT）是将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术（如右图所示）。1985年Smith等首次应用了该技术。

1988年Parmley和Smith将B-Gal表达于噬菌体的表面，并证实该蛋白有生物活性，可以被相应的抗体识别。随后，许多有功能的蛋白都被表达于噬菌体的表面，包括分泌性蛋白(如抗体、生长激素)、细胞内蛋白和酶类，为这些蛋白的基因工程改造奠定了基础。从理论上讲，任何蛋白只要能够分泌到细菌周质腔均可被表达于噬菌体的表面。1990年，George等证明噬菌体不会因外源性DNA片段的插入而影响其本身的粘附、侵入及整合。这种带有外源性基因片段的噬菌体感染宿主菌表达出外源性基因产物和PIII的融合体——融合壳蛋白，由于PIII的特殊定位，外源性片段得以在噬菌体表面表达，并同时保持了本身的三维结构和功能，进而使噬菌体成为一个理想的携带工具。Phagestructure:Fiberstructure1原理具体来讲噬菌体展示技术就是将待筛选基因插入噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因（主要是基因Ⅷ或基因Ⅲ）之间，构成融合蛋白噬菌体库。表达的融合蛋白可以呈现在噬菌体表面，但不影响噬菌体的完整性和活性。

噬菌体展示载体pCANTAB5E示意图噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高通量筛选的方法。其建立基于三个原则：在衣壳蛋白基因（主要是基因Ⅷ或基因Ⅲ）的N端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响也不干扰噬菌体的生活周期，同时保持了外源蛋白的天然构象，并能被相应的抗体或受体所识别。利用固定于固相支持物的靶分子，采用适当的筛选方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。展示文库的特点富集程度高，由此建立的展示文库的可达106

-1012位置明确，噬菌体的PIII蛋白定位特殊，定位于噬菌体的尾部，其氨基末端为噬菌体结合F纤毛噬菌体的衣壳蛋白有很大的可塑性大部分的蛋白质都可在其表面表达目前，能用于蛋白质、多肽展示的噬菌体系统有：丝状噬菌体展示系统λ噬菌体展示系统T4噬菌体展示系统T7噬菌体展示系统其中，T7噬菌体系统可以高、中、低拷贝展示不同分子量的蛋白，是目前最为理想的展示系统。单链丝状噬菌体展示系统PIII展示系统，主要用于获得高亲和力的克隆，形成单价表面展示体系PVIII展示系统，主要用于筛选亲和力较低的克隆，形成多价表面展示体系PVI展示系统

T4噬菌体展示系统

其病毒颗粒在宿主细胞内组装，不经过分泌途径，因而其表面展示多肽的范围更广，尤其适用于研究那些不能被大肠杆菌分泌的复杂蛋白质λ噬菌体展示系统（同上）可展示有活性的大分子蛋白（100kDa以上）以及对宿主细胞有毒性的蛋白，在后基因组时代前景相当可观应用的基本原理——（Panning)

将已经建立好的噬菌体文库进行淘选所谓淘选，是将展示文库作为流动相，而将与欲选择的重组基因产物的特异性的配体（或称靶分子）作为固定相，洗去不能与固定相特异结合的文库大部分成员，将特异结合的成员留下进一步扩增，并反复数轮淘选，即可将无用的基因去掉而将有用的基因富集并分离出来。Panningprocessing2应用（1）噬菌体展示技术与蛋白质工程

将编码随机多肽的寡核苷酸克隆到噬菌体展示载体上，构成一个高容量的噬菌体多肽文库时，该文库可用于特异性功能多肽的筛选。同样，利用噬菌体展示cDNA文库，可筛选出特定的蛋白质或基因。（2）噬菌体展示技术与抗体工程

噬菌体展示技术的出现使抗体工程进入第三次革命。噬菌体展示技术的成功应用之一就是噬菌体抗体库构建和单克隆抗体的筛选，利用此项技术可筛选到亲和力和特异性都令人满意的并且修饰过的抗体。将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合，使之表达于噬菌体颗粒的表面，就形成了噬菌体抗体。将全套的抗体可变区基因设计适当引物克隆出来，组建到表达载体内，再表达到许多噬菌体颗粒表面，则得到噬菌体抗体库（phageantibodylibrary）。（3）生产高效低价疫苗它能方便地大量生产疫苗用抗原表位，可以在同一噬菌体上展示多个具有保护性作用的抗原决定簇，构建多价疫苗。（4）研究诊断用疫苗（两种情况）

1在抗原决定簇已知的情况下，构建重组噬菌体可以为血清学分析提供大量的抗原来源，因为它不需要裂解宿主细胞而直接分泌到培养基中；抗原制备纯化简单，成本低下；噬菌体颗粒稳定，易于长期保存；能在同一个噬菌体同时展示不同的病原体的抗原决定簇。2在预先不知道诊断用靶抗原的情况下，使用患者血清从抗原决定簇库中筛选出展示特异性抗原决定簇的噬菌体，这种噬菌体只能与病人血清抗体反应，而不能与正常人的血清反应，从而建立起疾病的特异性诊断方法。(5)筛选酶抑制剂Norgren等利用该技术筛选到了7种酶系种的6种抑制剂，Dennis从肽库中筛选到能非竞争性地抑制丝氨酸蛋白因子VIIa活性的肽段3噬菌体展示技术的局限性

(1)在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子的多样性。(2)不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合。作为噬菌体的宿主，大肠杆菌的生物合成系统有本身的表达限制，不能进行氨基酸的修饰，蛋白质的糖基化或不能合成D型氨基酸。(3)噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。从建库开始，密码子的选择与寡核苷酸的合成，即编码肽的基因就带有一定的偏爱性，这就从先天决定了肽库复杂度即多样性的局限性。二、核糖体展示技术与mRNA展示技术

核糖体展示（Ribosomedisplay）技术与mRNA展示技术由于在体外无细胞翻译体系中进行，用mRNA的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，不受细胞转化效率的限制。它大大提高了文库容量和筛选通量（1012~1014），而且能够增加表达的蛋白质溶解度。核糖体展示技术的基本原理

核糖体展示技术的基本原理是通过PCR扩增目的基因的DNA文库，同时加入启动子、核糖体结合位点及茎环，并置于具有偶联转录-翻译的无细胞翻译系统中孵育，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面。去掉3′端的终止密码子,从而成功地使核糖体停留在mRNA3′末端,将蛋白质和mRNA连接在一起。并形成“mRNA-蛋白质-核糖体”三元复合体，最后利用常规的免疫学检测技术，通过固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利用RT-PCR扩增，进行下一循环的富集和选择，最终筛选出高亲和力的目标分子（如图所示）。核糖体展示原理示意图

核糖体展示的过程解离

5’随机DNA文库体外转录

5’体外翻译复合体形成

5’筛选

5’mRNA展示技术的原理

mRNA展示技术也是以mRNA和多肽复合体作为筛选的基本单元。其与核糖体展示的区别在于，复合体中mRNA与蛋白质通过一个小分子共价连接，如嘌呤霉素（如图所示），且该复合体的产生完全在体外，因此很容易构建大型突变文库（含1012~1013个独立序列）。

mRNA展示技术原理示意图嘌呤霉素是一种分子质量小、化学性质为稳定的氨酰tRNA类似物。当3‘端带有嘌呤霉素连接子的mRNA在体外翻译系统中完成翻译时，嘌呤霉素模拟tRNA末端的氨酰基结构，进入核糖体的A位点，抑制了蛋白质的翻译，在新生肽链和嘌呤霉素的O-甲基酪氨酸之间形成稳定的酰胺键，使mRNA的3’端与多肽的羧基端共价结合起来。三、细菌表面展示技术

细菌表面展示技术，结合荧光激活细胞筛选仪（FluorescenceActivatedCellSorting，FACS）或流式细胞筛选仪（flowcytometry）是非常有效的高通量筛选方法。此方法能够决定突变体库中每个克隆的功能特性。原理细菌表面有许多能显示保留单一性状在细胞表面的酶反应产物，因而展示在细菌表面的蛋白很容易通过荧光探针显示出来，荧光产物和细胞表面酶反应产物之间的物理连接是筛选蛋白质库的一个非常有价值的特性，同时也是定量检测单细胞酶催化活力的关键。这种技术是当前惟一能够定量检测单细胞水平和大量突变体酶催化活性的方法。流式细胞仪结合细菌表面展示技术具有以下几个明显的优点：能够定量分析酶活性、同时测定多个参数并且对每个观察到的克隆进行记录。与噬菌体肽库相比，细菌展示肽库还可用荧光激活细胞分选技术（FACS）进行更快速更高效筛选。细菌表面展示文库FACS筛选原理示意图

目前已有的多种细菌表面展示系统细菌的外膜蛋白、脂蛋白、表面附属结构亚单位如鞭毛、菌毛晶核蛋白（Icenucleationprotein，INP）、自体转运蛋白（Autotrans-porter）、S2层蛋白枯草杆菌的芽胞外膜，L2型大肠杆菌和变形杆菌的细胞膜

四、酵母表面展示技术

酵母表面展示系统是继噬菌体展示技术创立后发展起来的真核展示系统。酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似，对人的蛋白质表达和展示更具优越性。酵母细胞颗粒大，可用流式细胞仪进行筛选和分离。目前报道的两种酵母展示系统分别以α或a凝集素作为融合骨架。1目的蛋白-α凝集素表面展示系统

此系统将目的蛋白作为N端，与α凝集素C端部分融合，目的蛋白经α凝集素展示于酵母细胞表面。α凝集素共价连接到细胞壁的葡聚糖上，其锚定能力由蛋白质C端320个氨基酸决定，富含Ser/Thr残基。迄今，已经有多个应用α凝集素的C端作为融合蛋白的报道。第一个通过此系统表达的异源蛋白是α-半乳糖苷酶（如图）。2a凝集素-目的蛋白表面展示系统这是一种将目的蛋白作为C端与a凝集素Aga2p亚基的N端融合的表面展示系统。a凝集素通过与α凝集素相似的连接锚定在细胞壁上。与α凝集素不同，a凝集素由两个亚单位的糖蛋白组成。a-凝集素的组成a-凝集素由核心亚单位（Aga1p）和结合亚单位（Aga2p）两个亚单位组成，Aga1p共725个氨基酸，合成后被分泌到胞外，与酵母细胞壁的β－葡聚糖共价连接。Aga2p共69个氨基酸，合成后也被分泌到胞外，但其通过2个二硫键与Aga1p结合，仍与酵母细胞相连。Aga2p的N端部分参与二硫键的形成，外源蛋白通过与Aga2p的C末端融合可展示于酵母细胞表面（如图）。酵母表面展示技术的应用蛋白质的定向进化：酵母表面展示系统用于蛋白质亲和力和稳定性的定向进化已有成功报道，最先被用于抗体的亲和力成熟。活的口服疫苗：在细胞表面表达的蛋白质易于接近抗体，因此，可被免疫系统识别，即使很小的肽，当展示在细胞表面时，也具有免疫原性。因而可通过在酵母表面表达异质性的抗原蛋白来发展疫苗。第二节蛋白质分析鉴定技术

一、蛋白质芯片技术蛋白质芯片（proteinchip）技术是为满足人们对蛋白质的高通量、大信息量、平行分析研究而产生的。蛋白质芯片的产生将基因组学平台和蛋白质组学平台很好地连接起来。1蛋白质芯片的概念

蛋白质芯片（proteinchip）也叫蛋白质微阵列（proteinmicroarray)，是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片（如图）。图典型的蛋白质微阵列芯片2蛋白质芯片的分类根据用途的不同蛋白质芯片可分：

蛋白检测芯片蛋白功能芯片蛋白检测芯片：将具有高度亲和特异性的蛋白质或多肽，如单克隆抗体、小片段抗体、受体等固定在载体上，制备检测芯片用以识别复杂生物样品中的抗原、目标多肽和蛋白等。蛋白功能芯片：将天然蛋白、酶或酶底物固定在载体上制成芯片，主要用于天然蛋白活性及分子亲和性的高通量分析，可用来进行蛋白-蛋白、蛋白-多肽、蛋白-小分子、蛋白-DNA-RNA结合以及蛋白-酶反应的研究。3蛋白质芯片的制备

固相载体的选择和处理蛋白质靶标的处理将蛋白质靶标点在固相载体上蛋白质芯片的封闭CavinM等制作出高密度蛋白质微阵列

4蛋白质芯片中探针的标记

探针类型：蛋白质、酶或其它配基

标记物类型：荧光染料、酶，此外还有红色荧光蛋白（RFP）和绿色荧光蛋白（GFP）

5蛋白质芯片信号的检测及数据处理

信号检测：激光共聚焦检测、电荷藕合器件（CCD）检测数据处理：应用一定的计算机软件对检测中的扫描图进行处理，形成数据，得出结论。6蛋白质芯片的特点

快速、定量分析大量蛋白质；使用简单，结果正确率较高，只需少量血样标本即可进行分析和检测；采用光敏染料标记，灵敏度高，准确性好；所需试剂少，可直接应用血清样本，便于诊断，实用性强，其不足在于稳定性及操作复杂等因素限制。

7蛋白质芯片的应用

（1）基础研究方面的应用蛋白质—DNA相互作用研究:用生物化学表面芯片（PS20），以DNA作诱饵，结合特异蛋白质，用质谱法检测，筛查转录因子。蛋白质-mRNA相互作用研究:通过mRNA转录与RNA结合蛋白质的内在联系建立了一种高通量的方法，用于鉴定在结构上和功能上有关的mRNA转录。（2）临床方面的应用蛋白质芯片技术在临床方面有着广泛的应用，尤其是在疾病的诊断和疗效判定，即生物学标志物的检测上，蛋白质芯片技术具有很大的应用价值和前景。如应用于自身性免疫疾病的诊断，肿瘤的早期诊断等。由于蛋白质芯片是在分子水平进行诊断和预测的，因而它提供了一种更准确的方法。（3）新药研制方面的应用

研制一种新药往往要对上千种化合物进行筛选，低耗、快速、高效地筛选出新药或待选化合物是目前新药开发工作的重中之重。蛋白质芯片高通量、并行性的特点，大大地加快了化合物的筛选速度。蛋白质芯片技术还对中药现代化有巨大作用。利用蛋白质芯片跟踪药物所引起的蛋白质的表达就可以确定被检药物对人体是否有毒副作用，或达到多大剂量才会引起毒副作用。（4）环境监测及食品工业中的应用蛋白质芯片还