第七章-培养细胞中克隆基因的表达

第七章：培养细胞中克隆基因的表达及动物基因工程本章概述基因调控的研究（有关原核和真核生物的表达载体、报告基因等）基因在细胞系中表达的方法筛选阳性转基因动物细胞的遗传标记哺乳动物中瞬时转化载体（以SV40为例）基因定点敲除技术第一节基因调控的研究一、表达载体一类在多克隆位点的5‘端含有转录启动子的克隆载体。由于真核生物和原核生物启动子的不同，需要针对不同的宿主设计不同的载体。A、在大肠杆菌中的外源基因表达载体(1)典型的原核基因以及其RNA的特点转录终止序列

GC-richinvertedrepeat5’-GTCAAAAGCCTCCGGTCGGAGGCTTTTGACT

CAGTTTTCGGAGGCCAGCCTCCGAAAACTGA-5’RunofAresidues依赖ρ因子的终止子不依赖ρ因子的终止子真核基因的启动子不能被原核RNA聚合酶识别真核基因在原核生物中表达，必须把基因序列置于原核基因的框架内.(2)真核基因和原核基因的区别(3)启动子是表达载体的关键部分——选择启动子

······TTGACA

·····························TATAAT

····GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATATTGTCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTACGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGACACTTGATACTGTATGAAGCATACAGTATAATTGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTTAATGT

-35Region-10GegionConsensuslactrpλPLrecAtacItacII-10和-35碱基序列和通序启动子的强弱与它们与共有序列的相似程度有关。相似性越高，就越强；反之。。。。。序列盒和基因融合在载体上将启动子、核糖体结合位点和终止信号按较合理的置于载体上，这样的序列叫做序列盒外源基因插入在序列盒中间，通常与细菌的一段基因形成融合基因，所以在构建这类载体时，一定需要阅读框的正确。融合载体的四大优点：利用大肠杆菌天然序列，可以保证有效地翻译起始防止外源蛋白被降解可以被输出到胞外，利于纯化可以便于亲和层析(4)大肠杆菌中高效表达基因的策略优化表达载体的设计提高稀有密码子tRNA的表达作用提高外源基因mRNA的稳定性提高外源基因表达产物的稳定性优化发酵过程B、在真核细胞中外源基因表达载体真核生物的启动子序列包含：1）核心元件（TATA盒，起始子等）2）上游元件(CAAT盒等）3）远上游调控(增强子等）B、真核生物的表达载体通常含有真核基因的启动子序列表达载体的启动子区基本表达组成型表达细胞特异表达调节型表达MCSTATASP1AP1CAAT细胞特异调节型表达二、报告基因报告基因应满足的条件1）编码特异的蛋白酶活性，宿主细胞中没有2）酶活检测应快速、简便、灵敏等3）报告蛋白不影响宿主细胞的正常活性常用的GFP(YFP)、lacZ、GUS等第二节基因在细胞中的表达方法一、基因转染的策略

一般基因转化的的策略直接转化:用物理的方法直接将外源DNA转进细胞中去。

转染:用一系列物理和化学的方法迫使细胞能从周围的介质中接受DNA。�转导:动物病毒animalvirus一、基因转染的策略1.DNA/磷酸钙共沉淀的方法转化过程A、将待转染的DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液B、逐滴加入到Hepes-磷酸盐缓冲液中，形成磷酸钙-DNA共沉淀C、用吸管将共沉淀物加到培养的哺乳动物单层细胞表面，会迅速被细胞捕获，频率约10％（二）脂质体介导的转染脂质体(liposomes)是一种人造的脂质小泡，外周是脂双层，内部是水腔一、基因转染的策略一、基因转染的策略（三）电穿孔法在高压电脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞，从而促使不同细胞之间发生原生质体融合或促使细胞吸收外界环境中的DNA分子一、基因转染的策略（四）、直接转化－微注射真正的显微注射穿刺一、基因转染的策略二、瞬时转染（转化）外源DNA不与宿主的基因组DNA整合，转化细胞在较短的时间内进行转录和翻译。常用于较短时间的实验，如启动子功能检测，蛋白质亚细胞定位等三、稳定转化外源基因整合到细胞染色体中，随着细胞的分裂而传代（或子代的形成），产生稳定的转基因细胞系（或个体）。通常用于研究基因的功能或改变生物个体的性状。第三节：筛选阳性转基因动物细胞的遗传标记内源的选择标记这些基因存在于野生型的细胞中只能在相关基因发生了突变（失去功能）的突变体细胞中应用显性的选择标记赋予细胞一个完全新的表型，可以在多个细胞系中进行利用。哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记

遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH-氨基糖苷磷酸转移酶G418APH灭活G418DHFR二氢叶酸还原酶氨甲喋呤DHFR突变体抗氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸转移酶 潮霉素BHPH灭活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤TK合成TMPXGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA灭活Xyl-A1.胸苷激酶基因选择系统TK－细胞

把细胞培养在加有胸苷类似物5-溴尿嘧啶脱氧核苷（BUdR）的培养基中，在胸苷激酶（TK）的催化下，BUdR便掺入到细胞的DNA分子上，致使DNA复制出现错误。具有BUdR-DNA的细胞对UV特别敏感，被迅速地杀死，而少数TK－的细胞便能存活下来HAT选择法：在含有次黄嘌呤(Hypoxanthine)、氨基蝶呤(Aminopterin抑制了正常的核苷酸合成)和胸苷(Thymidine)的培养基中筛选TK+细胞共转化选择。在磷酸钙沉淀中，有两种形体上没有连接的DNA组成的混合物，能够同时转化受体细胞将无选择标记的DNA与具TK选择标记基因的DNA进行混合转化外源DNA可整合到核基因组的任何部位把TK基因先与非选择标记基因连接起来，也能共转化1.胸苷激酶基因选择系统90%的TK+细