(12.7.2.24)-血浆,血清及体液蛋白质组学

1

血浆/血清蛋白质组学和体液

蛋白质组学研究进展

2人类蛋白质组组织(HumanProteomeOrganization,HUPO)人血浆蛋白质组计划(HumanPlasmaProteomeProject,HUPOPPP)

人肝脏蛋白质组计划(HumanLiverProteomeProject,HLPP)3Ⅰ、血浆/血清蛋白质组学Ⅱ、尿蛋白质组学Ⅲ、唾液蛋白质组学Ⅳ、脑脊液蛋白质组学

4Ⅰ、血浆/血清蛋白质组学5人血液中的蛋白质来源几乎与所有细胞、组织、器官有关，可以直接反映机体的病理、生理状态，所以是发现各种疾病相关生物标志物的最有价值的标本，受到人们的广泛关注这是2006-12-22由Wiley-VCH出版的人血浆蛋白质学的专著6Clinicalproteomics:Writteninblood

LANCE

A.

LIOTTA,MAURO

FERRARI&EMANUEL

PETRICOIN.Nature

425,905(30October2003)血液中含有许多还不曾研究过的生物标志物，这些标志物能够反映出所有组织的生理状态。机体中的每一个细胞都可能将反映这种生理状态的记录以排泄物或信号分子的形式释放到血液中。7目前，常规的血液检查仅仅能反映血液所携带信息中的很少的部分。在疾病的早期诊断方面，人们迫切需要发现更为有效的疾病标志物，遗憾的是，迄今为止，为人们所公认的新的疾病标志物的数量极少。8血浆蛋白质组是最复杂的人类蛋白质组，其中包含着不同组织的亚蛋白质组。PlasmaPreteomePlasmaisthelargest,anddeepest,versionofthehumanproteomeLargest=MostproteinsDeepest=Widestdynamicrange9血浆中的蛋白质血浆大约含有7%的蛋白质，1%的其它物质，92%的水分。这些蛋白质包括维持机体正常生理状态的蛋白质，各种病理、生理状态下机体细胞和组织分泌、脱落的蛋白质。血浆蛋白质几乎包含了身体内所有的蛋白，总数估计在10,000种甚至更多。所含蛋白总量达到60-80mg/ml。从质量上看，血浆中总蛋白量的99%由为数不多的22种高丰度蛋白所占有。血浆中蛋白质浓度是在一个高动态范围内（9～12个数量级）变动——从35～50mg/ml的血清白蛋白，到1–10pg/ml或更低的趋化因子。101、组成性蛋白：主要指肝脏和小肠的分泌蛋白，它们在血浆中发挥作用，如白蛋白等；2、免疫球蛋白(Ig’sA,M,G,D,E)：血浆中大约含有数百万种抗体；3、组织渗漏蛋白：是因组织新陈代谢或发生病理改变导致细胞损伤、死亡而进入血液的蛋白质，这些蛋白质可用于疾病的诊断及愈后评价，如心肌钙蛋白(cardiactroponins)，或心肌红蛋白(myoglobin)用于诊断心肌梗塞；4、“远距离”受体和配体：包括肽类及蛋白质类激素，如胰岛素等；临时信使，如非激素类的蛋白，经血流转移至靶部位而起作用血浆蛋白质的组成从功能的角度可分为以下几类：受体是细胞表面或亚细胞组分中的一种分子，可以识别并特异地与有生物活性的化学信号物质（配体）结合，从而激活或启动一系列生物化学反应，最后导致该信号物质特定的生物效应。115、“局部”作用的受体和配体，包括细胞因子及细胞反应调节因子，e.g.,IL-8

；6、异常分泌蛋白，如前列腺特异性抗原（PSA）等肿瘤相关蛋白；7、一过性通过蛋白，如脂蛋白、溶酶体蛋白酶；8、外源蛋白，如异常微生物、寄生虫、病毒的病原蛋白或它们存留血液而释放的蛋白；9、小分子量的蛋白及多肽组份，主要是细胞因子、多肽类激素及较大蛋白的蛋白酶降解片断。12血浆中丰度最高的22种蛋白质A.

人血浆中十种丰度最高的蛋白质，它们占有总蛋白质量的大约90%。B.人血浆中十二种丰度较高的蛋白质，它们占有总蛋白质量的大约9%。

占质量数1%的蛋白质，其数量很多、含量很低，却又是我们十分关注的。13血浆中丰度最高的22种蛋白质A包括：清蛋白(Albumin)、IgGs、运铁蛋白(Transferrin)、纤维蛋白原(Fibrinogen)、IgAs、α-2-巨球蛋白(Alpha-2-Macroglobulin)、IgMs、α-1-抗胰蛋白酶(Alpha-1-Antitrypsin)、补体C3(ComplementC3)、结合珠蛋白(Haptoglobin)等十种。B包括：载脂蛋白A1(ApolipoproteinA1)、载脂蛋白A2(ApolipoproteinA2)、载脂蛋白B(ApolipoproteinB)、酸性-1-糖蛋白(Acid-1-Glycoprotein)、血浆铜兰蛋白(Ceruloplasmin)、补体C4(ComplementC4)、补体C1q(ComplementC1q)、IgDs、前清蛋白(Prealbumin)、血纤维蛋白溶酶原(Plasminogen)、H因子(FactorH)、脂蛋白[a](Lipoprotein[a])等十二种。14TPA,tissueplasminogenactivator;GCSF,granulocytecolony-stimulatingfactor;TNF,tumornecrosisfactor.Referenceintervalsfor70proteinanalytesinplasma.Dynamicrangeof2-DgelsorLC/MSClassicalPlasmaProteinsTissueLeakageInterleukins,etcHemoglobinisincludedforcomparison15Referenceintervalsfor70proteinanalytesinplasma.Abundanceisplottedonalogscalespanning12ordersofmagnitude.Whereonlyanupperlimitisquoted,thelowerendoftheintervallineshowsanarrowhead.Theclassicalplasmaproteinsareclusteredtotheleft(highabundance).Thetissueleakagemarkers(e.g.enzymesandtroponins)areclusteredinthecenter.Cytokinesareclusteredtotheright(lowabundance).Hemoglobinisincluded(farleft)forcomparison.16相对分子质量（kDa）蛋白质数量Histogramofthecalculatedmassesoftheprocessedformsof289proteinsobservedinplasma从相对分子质量的分布看，曾有研究工作对血浆中289种蛋白质的分子量分布进行了统计，表明10～100kDa的蛋白质占有相当大的比例，其中：

18%<20kDa69%<60kDa

KidneyPassedRetained17

识别蛋白质的数量（对数尺度）

年图中，有■点的〝1-D〞曲线表明在上个世纪三十至七十年代，使用传统的一维技术识别蛋白质数量的能力是有限的；有■点的〝2-D〞曲线表明在上个世纪七十年代至二十一世纪初，使用二维技术明显提高了识别蛋白质的能力；有■点的〝3+-D〞曲线表明在未来使用三维技术还会大大提高识别蛋白质的能力。有▲点的曲线表明基于测序法鉴定蛋白质的能力；而250*和490+则表示分别使用LC/LC/2-DE和LC/LC/MS/MS所达到的鉴定蛋白质的能力。18血浆/血清蛋白质组研究的

难度很大血浆/血清蛋白来源广泛、种类和数量多、丰度差异大、动态范围宽,这些特点给血浆/血清蛋白全谱蛋白的分离、检测和运用差异蛋白组学筛选肿瘤的生物标志物都带来了很大的挑战。目前，在比较蛋白质组学研究中，已有多种技术路线可以用于鉴定上千种甚至更多的哺乳动物细胞或组织来源的蛋白质，为在较宽的动态范围内得到重要的差异蛋白质提供了保证。但是，同样的技术路线用于血浆蛋白质组的研究，可鉴定的蛋白质数目要少得多，说明血浆蛋白质组研究的难度很大。19血浆/血清蛋白质组研究中需要

着重注意的问题1、样品的选择2、样品的收集与贮存3、去除高丰度蛋白和分级技术4、多维策略的运用20样品的选择血浆和血清都可以用于常规的生化实验室检查，虽然大多数情况下用血清的比较多，但是多数情况下用血浆替换血清，结果差异不大。在蛋白质组学研究中，选用血清或血浆的结果差异却很大，目前没有足够的资料表明选用血浆还是血清更为有利。21样品的收集与贮存①收集管：商品化收集管含有多种成分可能干扰或混淆质谱测定或数据；还可能含有一些促凝或抗凝物质；可能还会吸附一些低丰度蛋白，干扰血浆/血清中低丰度蛋白的鉴定。②抗凝剂种类，血清凝集时间，血浆孵育时间和温度。③贮存：研究表明存放在室温下4小时或6小时，其变化很小，但8小时后、特别是24小时后质谱分析结果有明显变化。对于在4℃下的结果与室温下结果差不多,但随着时间推移到48小时或96小时，就有非常显著的变化；长期存放在-20℃，-80℃，或液氮中没有太大的变化，但反复冻融次数增加却有很大影响。FreshPlasma4hours8HoursMarshalletal.,2006Qualitativeandquantitativechangestoproteinprofile23HUPOrecommendationsPlatelet-depletedplasmaispreferabletoserumforcertainpeptidomicstudies.(如果进行肽组学研究，则优先选择去除血小板的血浆）Samplesshouldbealiquotedandstoredinliquidnitrogen.（样品应分装并贮存在液氮中）Theadditionofproteaseinhibitorsisrecommended,butshouldbeincorporatedearlyandusedjudiciously,assomeformnonspecificproteinadductsandothersinterferewithpeptidestudies.(推荐使用蛋白酶抑制剂，但是应在早期合理地使用；应注意抑制剂可能某些非特异蛋白会形成加合物，还可能干扰肽的研究）Thediligenttrackingofpre-analyticalvariables.（应追踪样品在分析前的变化）24HUPOPPP在先期研究中采用了统一的参考样本标准1)血浆或血清参考样本收集处理必须在2h小时内完成；2)血浆采用用加入1.0ml枸橼酸钠(0.105mol/L)抗凝剂(与血的比例为1:9)或者采用喷雾干燥的EDTA为抗凝剂；血清在室温下30min内用微粉硅胶促凝后分离。分别收集10ml。3)分离在2-6℃下操作(枸橼酸血浆，血小板计数要小于130/ul)。离心后混合即分装到250ul硅烷化EP管中，-70℃保存。4)无HIV、HBV、HCV、HTLV-1(人类T细胞亲淋巴病毒1型)、梅毒，无任何肝损伤。5)整个过程不加cocktail等蛋白酶抑制剂。6)所有供血者应清晨空腹取血；24h内无服药和酒。此后的血浆蛋白质组学研究大多采用了这一套程序。TirumalaiR.S.,ChanK.C.,PrietoD.A.,etal.CharacterizationoftheLowMolecularWeightHumanSerumProteome.MolCellProteomics.2003,2:1096-110325用于蛋白质质谱分析的血液标本的处理、运送、操作及储存的标准条件建议4℃下处理血液标本，2h内尽快分离血清及细胞。用U9缓冲液(9molUrea,2%CHAPS,1%DTT)稀释血清后，可以24h内在室温下运送或对血清及WCX（弱阳离子交换）磁珠结合过程进行操作。血清应分装并长期储存在-80℃，但限冻融1次。溶血标本应弃用，建议重新取血。刘建栋等。血液蛋白质组与质谱仪检测流程标准化初探。基础医学与临床,2007,27(2)193-197CHAPS:3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸,两性离子表面活性剂DTT:二硫苏糖醇(dithiothreitol),

还原剂26去除高丰度蛋白血浆中的高丰度蛋白在很大程度上干扰了低丰度蛋白的检测。因此，从血清/血浆中获得标志性蛋白质的首要的一步就是如何去除其中的高丰度蛋白。27HighAbundanceProteinsinPlasmaorSerumLimitDetectionofMinorComponentsA:AlbuminB:TransferrinC:ApoA-IlipoproteinD:Haptoglobinβ-chainE:α1-AntitrypsinPPIWebsiteOct2002©，PlasmaProteomeInstitute28肝癌患者血浆的2-DE分离结果IPG4-7A:原血B:低丰度蛋白IPG4-7未去除高丰度蛋白的肝癌患者血浆的2-DE分离结果去除高丰度蛋白的肝癌患者血浆的2-DE分离结果29迄今为止，还缺乏一种能够解决所有蛋白纯化问题的技术和方案，但是，近年来已有越来越多的技术用于血清/血浆中高丰度蛋白的去除，方案也逐渐趋于成熟目前，对血清/血浆样品的处理一般的看法是，研究人员可以选择几种不同的分离和纯化技术，进行优化组合。目前市场上也针对种多元化（multi-pronged）策略推出了各种商品化的技术和方法，使得研究人员更方便地针对一些蛋白样品或者上游和下游技术设计实验。30目前，利用亲和色谱柱技术对高丰度蛋白进行选择性分离是主要的方法，常用的有基于抗体的亲和法和基于染料的亲和法。抗体亲和法利用抗原抗体反应的原理，用针对血浆中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除血浆中的高丰度蛋白。染料亲和法通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键相互作用去除血浆中的高丰度蛋白，其特异性相对较低。已有数种方法实现了商品化，分别可以去除2种、6种、12种或20种高丰度蛋白。31亲和柱去除高丰度蛋白ProteomeLab

IgY蛋白质组分组分离系统(BeckmanCoulter公司

)ProteoExtractAlbumin/IgG高丰度蛋白去除试剂盒

(MERCK公司

)Aurum™Serum高丰度蛋白去除试剂盒(Bio-Rad公司

)

安捷伦高丰度蛋白去除柱（AgilentMultipleAffinityRemovalColumn，MARC）ProteoPrep®20PlasmaImmunodepletionKit(PROT-20)去除血浆中20种高丰度蛋白的实验方案(Sigma-Aldrich公司

)32HHLLLLLLLLLL人体血清样本低丰度蛋白HHHHHHHLLLLL高丰度蛋白(白蛋白,免疫球蛋白G,免疫球蛋白A,转铁蛋白,结合珠蛋白,抗胰蛋白酶)低丰度蛋白(疫病生物标记和药物靶点)H蛋白清除专用柱6种高丰度蛋白同时清除33血清/血浆中高丰度蛋白的清除柱抗-白蛋白-树脂抗-转铁蛋白-树脂抗-结合珠蛋白-树脂抗--1-抗胰蛋白酶-树脂抗-免疫球蛋白A-树脂抗-免疫球蛋白G-树脂每种抗体以特定比率混合后，装填成色谱柱的形式34血清/血浆中高丰度蛋白的去除其他15%白蛋白54.31%免疫球蛋白G16.61%

-1-抗胰蛋白酶3.83%免疫球蛋白A3.45%转铁蛋白3.32%结合珠蛋白2.94%1DGEor2DGE蛋白表达药物靶点疾病标注定性分析35分级技术在使用蛋白质组学技术之前对血浆蛋白进行预分离，可以降低血浆样品的复杂度，改善2-DE分离血浆蛋白的效果，有利于分离鉴定血浆中的低丰度蛋白。常用的血浆蛋白预分离的方法包括二维液相色谱(2DLC)，尺寸排阻色谱/反相高效液向色谱(SEC／RP-HPLC)，阳离子交换色谱/反相高效液向色谱，二维毛细管电泳(2DCE)，ZoomIEF组分分离、Gradflow及自由流电泳（FFE）等。

2D1D3D4DPlasm/SerumPlasm/SerumPlasm/SerumPlasm/Serum1LC-MS/MSrun20-40LC-MS/MSruns100-150LC-MS/MSruns100-150LC-MS/MSruns1DSDSPAGEMicroSol-IEF1DSDSPAGE1DSDSPAGEMicroSol-IEFMajorProteinDepletion～100～800-1000～2000+～2800+UniqueProteins多维策略在血浆蛋白质组鉴定中的优势MicroSol-IEF：microscalesolutionIEF

微量等电聚焦电泳37当前临床蛋白质组学的研究重点之一就是从血液样品中发现生物标志物。1、血浆/血清是临床检查最主要的样本来源，对疾病诊断和疗效监测具有重要的意义；2、血浆蛋白取材方便，能够获得足够的研究样本，容易标准化；3、血浆蛋白的性质具有很大的动态范围；4、多数血浆蛋白的表达水平与其相应的mRNA表达水平间的相关性很差；且蛋白质普遍存在糖基化、磷酸化等翻译后修饰现象。因此，只能从蛋白质水平上开展研究。38生物标志物（Biomarkers）生物标志物或称生物标记，原指表示机体失衡时的体温、血压或心率等生理指标，用来作为反映疾病症状的直接性证据。后来，该词语还表示可检测的外来物质，如放射性同位素，将这种物质引入人体系统来指示特定器官或机体功能出现的问题。如今，将生物标志物更精确地定义为可提供机体状态信息的指标，如血液检测、基因序列或突变、mRNA表达谱或组织蛋白等。39生物标志物与有效生物标志物的定义美国国立卫生研究院1998年12月举行的研讨会将生物标志物(biomarker)定义为“经过客观测量和评估的一种特性，可作为正常生物学过程、致病过程或干预疗法的药理反应的一种指标”。该定义发表于BiomarkersAndSurrogateEndpoints:PreferredDefinitionsandConceptualFramework(ClinicalPharmacology&Therapeutics,Volume69,No3,2001)。2005年，FDA公布了“药物基因组学数据呈报指南”（GuidanceforIndustryonPharmacogenomicDataSubmissions），对“有效生物标志物”（Validbiomarker）进行了定义，认为“有效生物标志物”是一种得到广泛认可的，具有生理学、毒理学、药理学或者临床意义的指标”。40理想的生物标志物应当具备以下三个基本特征：1、与疾病发生、发展机制紧密相关，从而具有较好的诊断、危险性分类和预后评估的价值。2、真实性

①具有良好的灵敏度和特异性。灵敏度是试验判断为阳性人数占真正患病人数的比例，特异性是实验结果判断为阴性人数占真正无病人数的比例。若检测灵敏度低，则有可能会出现假阴性；而低特异性则有可能出现假阳性检测结果。②具有可预测性。常用预测值（predictivevalue，PV）表示，包括阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV），前者指试验阳性者患病的可能性，后者指试验阴性者无病的可能性。③能有效地用于临床疾病的分型。3、检测方法可实现标准化，易于掌握和推广应用，具有非创伤性，适合于高通量分析，费用适当。41有效生物标志物根据其临床应用，可分为以下类别：1、用于早期检测与诊断的生物标志物（Diagnosticmarkers）。2、用于预后的生物标志物（Prognosticmarkers）。3、用于预测的生物标志物（Predictivemarkers）。4、药效学生物标志物（Pharmacodynamicmarkers）5、应答与功效性生物标志物（Responseandefficacymarkers），在个体化治疗方案中，评价患者个体对于治疗措施的反应性。6、预测药物毒性的生物标志物（Toxicitypredictionmarkers）。MarkerDiscoveryFinalBiomarkerTargetDevelopment

DiagnosticTestDevelopmentSamplePreparationConvergentValiditytestingMulti-DLC/MS/MSIntracellularProgramTissueSELDI/MALDIMS/MScDNAarraysHomogenates/LCMCellsExtracellularProgramCellCulturePlasmaorotherfluidsSecretedProteinSurfaceProteinFluidProteinPosttranslationalmodification/mutationcharacterizationPolyclonal/MonoclonalABProductionProgramTissuemicroarraysELISAtestsProteinChipsWesternBlotRT-PCRLC-MRMImmunochemistryFT-ICRMS傅立叶变换-离子回旋共振质谱法liquidchromatography/multiplereactionmonitoringmassspectrometry

(LC/MRM-MS)激光捕获显微切割(lasercapture

microdissection,LCM)43一个案例:Reversed-PhaseHigh-PerformanceLiquidChromatographicPrefractionationofImmunodepletedHumanSerumProteinstoEnhanceMassSpectrometryIdentificationofLower-AbundantProteins.JamesMartosella,etal.JournalofProteomeResearch.

2005,4,1522-1537ExperimentalWorkflow◆以免疫亲和色谱法去除人血清样品中的六种高丰度蛋白；◆以使用大孔硅胶C18柱的RP-HPLC方法对去除高丰度蛋白后的血清样品进行分级(柱温80℃)；◆分别收集RP-HPLC所得到的各个馏份；◆再以SDS或LC对各个馏份进行分离；◆对分离后的成份分别进行酶解；◆对酶解后的肽混合物用MALDITOF/MS或LCMS/MS进行分析；◆最后进行生物信息学数据库搜索。45Lane2:crudeserumLane3:flow-throughLane4:boundfractionsLanes1and5:molecularweightstandardsOnthebasisoftheproteinassayoftheflow-throughfraction,85%oftotalproteinwasremovedfromthecrudeserum.高丰度蛋白的去除效果46ComparisonoftheRP-HPLCelutionprofiles(absorbanceat280nm)forcrudehumanserum,showninPanel(A),andhumanserumdepletedofhigh-abundantproteins,showninPanel(B).A:crudehumanserumB:ImmunodepletedHumanserum去除高丰度蛋白后的分离效果47SDSanalysisofRP-HPLCfractionatedimmunodepletedhumanserumfromanmRP-C18column(9.4mm×ID50mm).48Panel(A).OverlayoftheEICs(m/z1121.1-1123.3)correspondingtoaselectedpeptideidentifyingtheproteininter-alphatrypsininhibitorheavychainH2precursor(ITIH2).TheelutionprofilepresentedisforthenanosprayLC-MSforthispeptide.Panel(B).AnexemplaryMS/MSspectraforthefractionandtheunfractionatedsamplefortheselectedpeptide,whichcontributedtothepositiveidentificationoftheprotein.对酶解后的一个肽段的LCMS/MS分析结果49Ⅱ、尿蛋白质组学

UrinaryProteomicsUrinehasbecomeoneofthemostattractivebiofluidsinclinicalproteomicsasitcanbeobtainednon-invasively(无创地)inlargequantitiesandisstablecomparedwithotherbiofluids.50尿液的生成肾脏是生成尿液的器官。尿直接来源于血液。尿的生成主要经过3个过程：

(1)肾小球的滤过作用。血液流经肾小球时，血浆中的水分和其它物质(电解质和小分子有机物)从肾小球滤过，而形成肾小球滤过液，即原尿。

(2)肾小管的重吸收作用。原尿经过肾小管，99%的水分，葡萄糖和蛋白质等营养物质也全部被重吸收到血液中。钠离子、氯离子、水和尿素主要是在近曲小管重吸收。

(3)肾小管和集合管的分泌作用。尿中有相当一部分物质是由肾小管和集合管上皮细胞将它们周围毛细血管血液中的一些成分，以及这些细胞本身产生的一些物质分泌或排泄到管腔中的。51尿液中的蛋白质来源尿蛋白质组学已有的研究结果表明，正常人的尿液中存在1500种以上的蛋白质，还有数量更多的源自大蛋白质分子裂解的多肽片段。它分为可溶性蛋白与固相成分两个部分。

52尿蛋白质的来源:可溶性蛋白来源注释肾小球滤过(Glomerularfiltrationofplasmaproteins)正常尿液中含量<150mg/日；肾小球滤过功能降低会增加尿液中高分子量蛋白（如清蛋白）的含量；近端肾小管（proximaltubule）吸收功能降低或血浆中异常的低分子量蛋白会增加尿液中低分子量蛋白（如ß2-微球蛋白、免疫球蛋白轻链、生素A键合蛋白）以及氨基酸的含量。上皮细胞分泌(Epithelialcellsecretionofsolubleproteins)来自胞外分泌的蛋白，如表皮生长因子（epidermalgrowthfactor）或由糖基化磷脂酰化肌醇锚定蛋白（glycosyl

phosphatidyl

inositol-anchoredprotein）分解得到的蛋白，如Tamm-Horsfall蛋白（Tamm-Horsfallprotein）。53尿蛋白质的来源:固相成分来源注释上皮细胞(注1)1.全细胞脱落2.质膜与细胞内成分脱落3.免疫细胞胞外体(exosomes)分泌(注2)

1.在某些疾病状态，尿中会出现上皮细胞数量增加，包括：在急性肾小管坏死时的肾小管细胞脱落，肾小球疾病时的足突状细胞脱落(podocyteshedding)2.可能与非特异性的肾脏损伤或凋亡过程有关3.Exosomes又称外泌体，是由细胞分泌到胞外的囊泡状小体,体内多种细胞[如T-cells,mastcells,DCs,platelets,neurons,epithelialCells]可以分泌外泌体。其它细胞在某些疾病状态，尿中会出现红细胞，白细胞，或肿瘤细胞（如膀胱癌细胞，淋巴瘤细胞）注1：上皮细胞包括尿足细胞（urinarypodocytes）、尿道上皮细胞在内的各种泌尿器管道的上皮细胞;注2：

Exosomesaresmall(30-100nm)vesiclesthatoriginate

asinternalvesiclesinmultivesicularbodiesandareexcreted

fromthecellwhentheoutermembraneofthemultivesicular

bodyfuseswiththeplasmamembrane.54Urinary

exosomes100nmPatriciaGonzales,Trairak

PisitkunandMarkA.Knepper.Urinaryexosomes:isthereafuture?NephrologyDialysisTransplantation200823(6):1799-180155尿蛋白质组学的研究意义Intheclinicalarea,e.g.intheearlydiagnosisofdisease

inclassificationofdiseasewithregardtolikelytherapeuticresponses

inassessmentofprognosis

inmonitoringresponsetotherapy.Theseapproacheshavepotentialvalue,notonlyindiseasesofthekidneyandurinarytract,butalsoinsystemicdiseasesthatareassociatedwithcirculatingsmall-proteinandpeptidemarkersthatcanpasstheglomerularfilter.56MatthiasMann,etal.

GenomeBiology,2006,7:R80Weemployed1DSDSandRPHPLCforproteinseparationandfractionation.(以1DSDS和

RPHPLC对尿蛋白质组进行分离和分级)

Fractionatedproteinsweredigestedin-gelorin-solution,anddigestswereanalyzedwiththeLTQ-FTandLTQ-Orbitrap.(对分离和分级后的蛋白质组成份进行胶上或溶液内酶解,以LTQ-FT

和

LTQ-Orbitrap两种质谱仪进行MS、MS2、MS3分析)Weidentified1543proteinsinurineobtainedfromtenhealthydonors,whileessentiallyeliminatingfalse-positiveidentifications.(从十名健康受试者的尿中鉴定出了1543种蛋白,这一结果是在排除了假阳性结果后得到的)571D,one-dimensional;HPLC,high-performanceliquidchromatography;HSA,humanserumalbumin;MW,molecularweight;LC,liquidchromatography;MS,massspectrometry;SDS,sodiumdodecylsulfate.Anoverviewoftheprocedureusedforanalysisoftheurinaryproteome.58Surprisingly,nearlyhalfoftheannotatedproteinsweremembraneproteinsaccordingtoGeneOntology(GO)analysis.(令人惊讶的是,对这些结果的GeneOntology(GO)分析表明,几乎有一半是膜蛋白)Furthermore,extracellular,lysosomal(溶酶体),andplasmamembraneproteinswereenrichedintheurinecomparedwithallGOentries.(与GO的搜索结果相比,细胞外蛋白、溶酶体和细胞质膜蛋白均在尿中得到富集)Plasmamembraneproteinsareprobablypresentinurinebysecretioninexosomes.(尿中的细胞质膜蛋白可能来自exosomes的分泌)GeneOntology（GO）包含了基因参与的生物过程，所处的细胞位置，发挥的分子功能三方面功能信息，并将概念粗细不同的功能概念组织成DAG（有向无环图）的结构。GeneOntology是一个使用有控制的词汇表和严格定义的概念关系，以有向无环图的形式统一表示各物种的基因功能分类体系，从而较全面地概括了基因的功能信息，纠正了传统功能分类体系中常见的维度混淆问题。在基因表达谱分析中，GO常用于提供基因功能分类标签和基因功能研究的背景知识。利用GO的知识体系和结构特点，旨在发掘与基因差异表达现象关联的单个特征基因功能类或多个特征功能类的组合。59Comparisonofidentifiedproteinsinurineofasinglepersonandpooledurinefromninepersons.Theratioofmembrane,plasmamembrane,lysosome,andextracellularregionproteinsineachdatasetwerecalculatedusingBiNGO.GO,GeneOntology.(a)Overlappingproteins(b)molecularweightdistribution(c)cellularlocalizationwerecompared60Proteomemapof

humanurineTheurinesampleswerefractionatedbytwodifferentmethods.Theproteinswereseparatedby2D.BAacetoneprecipitation（丙酮沉淀）Ultracentrifugation（超速离心）Visith

Thongboonkerd,etal.Proteomicanalysisofnormalhumanurinaryproteinsisolatedbyacetoneprecipitationorultracentrifugation.KidneyInternational,Vol.62(2002),pp.1461–1469612-DEcomparingtheurineofseptic（败血症）

ratswithoutARFtosepticratswithARF.Urinewaspooledfromthreeanimalsforeachgroup.RedindicatesincreasedproteinabundancewithARF(AcuteRenalFailure,急性肾功能衰竭).GreenindicatesdecreasedproteinabundancewithARF.Yellowindicatesnochangeinabundance.ThespotlabeledAisventralprostate-specificproteinwhichdidnotchangeinabundance.62一个案例：激素敏感型与激素耐药型先天性肾病综合征的SELDI-TOF-MS研究RobertP.Woroniecki,etal.UrinaryProteomeofSteroid-SensitiveandSteroid-ResistantIdiopathicNephroticSyndromeofChildhood.AmJNephrol.2006,26:258～26763表面增强激光解吸离子化

飞行时间质谱

Surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry(SELDI-TOFMS)这是一种应用特殊的增强表面或芯片结合激光解吸离子化．飞行时间质谱分析样品中蛋白质的技术，具有微量、快速、高通量等特点，尤其适于分析低分子量、低丰度的蛋白质。64ImprovedReproducibilityBetterSampleHandlingIncreasedThroughputReduceCrossContaminationSerumSampleLoadingOneMicroliterofSerumRobotichandling65ABC1μl血清加到蛋白质芯片上蛋白质芯片对目标蛋白进行选择性捕获TOF-MS质谱分析数据处理

疾病诊断66疏水性蛋白质芯片H50

弱阳离子交换蛋白质芯片WCX强阴离子交换蛋白质芯片SAX2固定化金属亲合捕获蛋白质芯片IMAC30

正相蛋白质芯片NP20

67以羰基二咪唑预活化的蛋白质芯片RS-10以环氧化合物预活化的蛋白质芯片PS-20诱饵化合物中的胺基与预活化基团共价结合形成不同种类的生物化学表面芯片

抗体芯片受体芯片DNA芯片68SELDI的数据再现形式69

BiomarkerDiscoveryMarkerscanbeeasilyfoundbycomparingproteinmaps.SELDIisfasterandmorereproduciblethan2DPAGE.Hasbeenusedtodiscoverproteinbiomarkersofdiseasessuchasovariancancer,breastcancer,prostateandbladdercancers.(ModifiedfromCiphergenWebSite)70SELDI蛋白指纹图谱技术的优点：①直接用粗生物样品进行分析，适用面广；②样品用量少，只需0.5－5μl，或2000个细胞即可检测；③通过蛋白质芯片捕获目标蛋白质，降低了样品中蛋白质成分的复杂性，从而有利于发现低丰度、小分子量蛋白质，并能检测疏水蛋白质特别是膜蛋白质；④可同时快速发现多个生物标记物；⑤灵敏度高；⑥在同一系统中集分离，纯化，鉴定，检测和数据分析为一体，高通量，操作自动化，快捷方便；⑦对样品中的盐和其它杂质有较高的兼容性。

71激素敏感型与激素耐药型先天性肾病综合征的SELDI-TOF-MS研究激素耐药是肾病综合征治疗过程中遇到的棘手问题。由于激素敏感型（Steroid-Sensitive，SS）INS与激素耐药型（steroid-resistant，SR）INS的临床鉴别有很大的难度，因此，如何对激素耐药型肾病综合征（SRINS）极早期诊断并及时制定治疗方案为临床所期望。RobertP.Woroniecki等建立了一种基于SELDI-TOF-MS的研究策略。分别以CM10,IMAC30,H50和Q10蛋白质芯片对激素敏感型NS、激素耐药型NS进行分析。72实验结果表明，使用不同的蛋白质芯片分析激素敏感型INS或激素耐药型INS患者尿样，均在不同的相对分子质量区域出现了差异蛋白条带。经BPS综合分析，最终确认质量数4,144Da的条带在从激素敏感型NS患者中鉴别激素耐药型NS患者具有特别重要的意义。73激素敏感型样品在CM10上的分析结果激素耐药型样品在CM10上的分析结果激素敏感型样品在Q10上的分析结果激素耐药型样品在Q10上的分析结果激素耐药型样品在H50上的分析结果激素耐药型样品在IMAC-30上的分析结果激素敏感型样品在H50上的分析结果激素敏感型样品在IMAC-30上的分析结果74Ⅲ、唾液蛋白质组学

SalivaryProteomics以“组学”的研究思路寻找、发现和鉴定唾液中与疾病过程与治疗过程相关的生物标志物（蛋白质、多肽），阐明疾病的发病机理，建立新的临床诊断指标。75下颌下腺唾液（Saliva）唾液（Saliva）是口腔粘膜下唾液腺（主要是腮腺、舌下腺、下颌下腺）的分泌产物。越来越多的研究结果表明，唾液与血液、尿液一样，是在疾病的临床筛查、诊断中具有重要意义的诊断样品。人体的多种疾病、均能对影响唾液成份，由此提供局部或全身性病症的线索和状况。舌下腺腮腺三叉神经面神经76唾液的组成口腔中的唾液称全唾液（Wholesaliva，WS），是口腔环境中最重要的液体成份。全唾液无色无味近于中性（pH6.6-7.1）的低渗液体，正常成人每日分泌量1.0～1.5L。它是一种成份极为复杂的体液，其中水分约占99%，含有酶、酶阻滞物、生长因子、细胞因子、免疫球蛋白、粘液素、糖蛋白和少量无机盐等。77毛细血管毛细血管血液血液唾液唾液分泌是一个复杂的过程它包括：a：血清成分的选择性主动转运；b：脂溶性成分的被动扩散；c：选择性成分的简单过滤；d：腺泡细胞活化泵将水合Na+转运至唾液腺导管；e：唾液腺导管细胞将低渗唾液中的Na+泵回血液。图中，f为细胞膜，g为细胞膜孔，h为细胞间隙，i为腺泡细胞。由此可见，唾液成分与血清成分是有密切关系的。唾液中的主要功能蛋白质SalivaryFamiliesAnti-BacterialBufferingDigestionMineral-izationLubrication&ViscoelasticityTissueCoatingAnti-FungalAnti-ViralCarbonicanhydrases,HistatinsAmylases,Mucins,LipaseCystatins,Histatins,Proline-richproteins,StatherinsMucins,StatherinsAmylases,Cystatins,Mucins,Proline-richproteins,StatherinsHistatinsCystatins,MucinsAmylases,Cystatins,Histatins,Mucins,Peroxidases79口腔唾液腺蛋白质谱口腔唾液腺蛋白质谱是指三种分泌唾液的腺体：腮腺（parotid）、下颌下腺（submandibular，SM）、舌下腺（sublingual，SL）各自分泌物中的全部蛋白质成分。目前的研究集中在SM和SL蛋白质谱的分析。SL液是一种纯的口腔液体，而SM液则是下颌下腺液与舌下腺液的混合物，SM/SL为7/9。有关研究工作表明，SL液与SM液中的蛋白质成份是有差别的。80唾液蛋白质组学的主要研究内容①发现新的唾液生物标志物（salivarybiomarkers）与药物作用靶点；②唾液蛋白质组学的分析技术；③齿龈沟液（gingivalcrevicularfluid）的蛋白质组学分析；④肿瘤诊断中的唾液蛋白质组学；⑤舍格伦综合征（Sjogren‘sSyndrome）的蛋白质组学（舍格伦综合征为一种自身免疫性疾病，其特征表现为外分泌腺的进行性破坏，导致粘膜及结膜干燥，并伴有各种自身免疫性病征。90%发生于中年妇女。主要临床表现为口腔、眼和其他部位粘膜干燥，常合并发生类风湿性关节炎。）；⑥糖尿病患者的唾液分析；⑦唾液转录组学（salivatranscriptomics）。81国外研究进展美国加利福尼亚大学洛杉叽分校于2004年开展了UCLA人类唾液蛋白质组计划（HumanSalivaryProteomeProject）。美国国立卫生研究院（NIH）已于2005年开展了名为“SalivaryProteomicsinDiseaseandHealth”的研究项目。82全唾液蛋白质谱研究

Shen

Hu等用LCMS/MS鸟枪法和2-DEMS对人唾液蛋白质组开展了大规模鉴定，使用两种策略一共在全唾液中鉴定出310种蛋白。其中最主要的酸性蛋白质包括组织蛋白酶L（cathepsinL，pI4.36）、透明质素结合蛋白（hyaluronan-bindingprotein，pI4.38）。最主要的碱性蛋白是唾液富脯氨酸糖蛋白PRB2（salivaryproline-richglycoproteinPRB2，pI12.03）和一个等电点在12.08的未知蛋白。所鉴定的蛋白中最微量的蛋白是T细胞受体β链片段（T-cellreceptordeltachainfragment，Mr2.9kDa）、防御素HNP-3链A（defensinHNP-3,chainA，Mr3.5kDa），后者是从人的嗜中性白细胞分离纯化出的3种阳离子小肽（HNP-1、HNP-2与HNP-3）中的一种，具有抑制艾滋病病毒复制的功能。相对分子质量最大的蛋白质是粘蛋白5B（mucin5B，Mr590kDa）。Shen

Hu,etal.Large-scaleidentificationofproteinsinhumansalivaryproteomebyliquidchromatography/massspectrometryandtwo-dimensionalgelelectrophoresis-massspectrometry.Proteomics,2005,5(6):1714～172883Ⅳ、脑脊液蛋白质组学脑脊液中的蛋白质组的变化被认为是与许多中枢神经系统疾病有关84脑脊液脑脊液为无色透明的液体，充满在各脑室、蛛网膜下腔和脊髓中央管内。脑脊液由脑室中的脉络丛产生，与血浆和淋巴液的性质相似，略带粘性。正常成年人的脑脊液约100-150毫升，不含红细胞，但每立方毫米中约含在5个淋巴细胞。脑脊液具有保护和营养脑及脊髓的作用。正常脑脊液具有一定的化学成分和压力，对维持颅压的相对稳定有重要作用。患中枢神经系统疾病时，常常要作腰椎穿刺吸取脑脊液检查，以协助诊断。如果脑脊液产生过多，或循环通路受阻，均可导致颅内压升高。85一个案例：

ComparativeProteomicAnalysisofIntra-andInterindividualVariationinHumanCerebrospinalFluidYan

Hu,etal.Molecular&CellularProteomics4:2000-2009,2005.

该论文是以2-DDIGE对脑脊液蛋白质组开展的一项方法学研究工作，为从CSF中发现与评价与中枢神经系统疾病有关的生物标志物建立新的技术路线。双向荧光差异凝胶电泳分析(2-DDIGE)86荧光双相差示凝胶电泳

fluorescencetwo-dimensionaldifferentialgelelectrophoresis(2-DDIGE)1.一个样品的蛋白全部用花青荧光染料（cyaninedyes）丙基-Cy3标记。2.对照样品用激发波长不同、化学性质类似的另外一种花青荧光染料丙基-Cy5标记。3.两种标记过的样品混合到一起,在同一块胶上进行电泳分离。4.进行荧光识别,通过不同波长的扫描,观察一个蛋白质点处两种荧光密度的深浅和有无,可以得到特定蛋白质点的丰度变化、蛋白质的缺失或判定新蛋白质的出现。872-DDIGE的操作流程882-DDIGE的优点为：①两种样品在同一块胶上分离，与传统的2-DE方法相比，重现性有了较大的提高，可以更直观地观察两组样品的差异表达；②该方法在四个数量级的范围内可以进行蛋白点（带）的定量，动态范围比银染、考染及胶体考染更宽；③操作时间短，标记反应只需要45分钟；④荧光标记不影响质谱分析；⑤检测灵敏度为0.8ng/蛋白点（这意味着样品量为1g时，可以在100个拷贝/细胞的量级检出蛋白质）。缺点是该方法只适用于含有赖氨酸的蛋白质的标记，对赖氨酸含量少的蛋白质的标记也有困难，大部分未