马铃薯金线虫孢囊线虫的检测方法研究

马铃薯金线虫孢囊线虫的检测方法研究

中国是世界上最大的甘薯种植国（约19%）。在中国,马铃薯既是粮食作物又是重要的经济作物,因此马铃薯生产在国民经济中占有举足轻重的地位。马铃薯孢囊线虫(马铃薯金线虫Globoderarostochiensis和马铃薯白线虫G.pallida合称)起源于南美安第斯山脉,是马铃薯上毁灭性的线虫,也是国际上公认的重要检疫性有害生物。据估计在欧洲每年造成的经济损失达3亿欧元,目前已经随带土的马铃薯种薯传播到几乎所有的马铃薯生产国家。由于我国采取了严格的植物检疫措施,禁止从疫区国家输入马铃薯种薯,马铃薯孢囊线虫目前在我国尚未发生。然而,采取零风险植物检疫措施的做法已难以为国际社会所接受,中国在入世谈判过程中,分别与加拿大和荷兰签署了进口马铃薯种薯的植物检疫议定书,其后又与美国、英国签署了类似的议定书。马铃薯金线虫与白线虫的形态学特征非常相似,难以区分。传统的马铃薯孢囊线虫鉴定必须借助于一定数量特征性的孢囊或雌虫,并结合2龄幼虫特征,同时需要一定数量的线虫样品。而输华的马铃薯种薯带土量极小,截获完整的孢囊进行鉴定是不切实际的,如在1998-1999年开展的中荷马铃薯种薯隔离试种试验中,作者就曾截获单条孢囊线虫的幼虫,但无法确定为何种孢囊线虫。鉴于此,开展马铃薯孢囊线虫的分子检测技术研究尤显必要。为解决该线虫的鉴定困难问题,近年来开展了诸多马铃薯孢囊线虫的分子检测技术研究,如RAPD、RFLP、普通PCR、AFLP等,多数研究仅限于如何区分马铃薯金线虫和马铃薯白线虫。尽管上述研究方法是有效的,但仍然需要较长的时间,难以满足口岸检疫快速放行的需要。实时荧光PCR技术已广泛应用于植物病原真菌、细菌、病毒等的检测与定量,也报道可成功检测松材线虫、马铃薯白线虫和甜菜孢囊线虫。1材料和方法1.1马铃薯孢囊线虫样品的测定共收集到15个马铃薯孢囊线虫群体,分别来自比利时、英国和俄罗斯(见表1),所有的马铃薯孢囊线虫均是已灭活的样品,并在小塑料管中于4℃下保存了数年。棘皮线虫(Cactoderasp.)是上海口岸从来自日本的植物种苗中截获的,共20多条2龄幼虫。1.2其他新鲜的线虫样品的提取马铃薯金线虫和白线虫分别用20个孢囊提取DNA,按购买的基因组DNA试剂盒(Wizard,Promega)说明书进行提取。其他新鲜的线虫样品DNA提取按Cao等的方法。为了获得马铃薯金线虫的标准曲线,按上述方法至少使用200个孢囊提取DNA。使用核酸蛋白质分析仪Du(BeckmanCoulterTM)在260nm光谱下测定DNA浓度,若需要的话用超纯水稀释。为了验证提取的DNA情况,使用AB28和TW81通用引物来扩增所有样品的核糖体DNAITS区,确保线虫DNA的存在。1.3实时荧光pcr检测从GenBank下载所有孢囊类线虫的ITS序列,利用ClustalX1.8.1软件(PEAppliedBiosystem,FosterCity,CA)设计实时荧光PCR引物,利用PrimerExpresssoftware(PEAppliedBiosystems)软件设计特异性探针,并返回GenBankBlast数据库进行特异性比对。所有引物和探针均由商业性公司合成。1.4taqman聚合酶本研究使用的荧光PCR仪为ABIPRISM7700。采用25μL反应体系,包括2.5μL10×反应缓冲液(1mmol/LTris-HCl,pH9.0,5mmol/LKCl,0.01%TritonX-100),2mmol/LMg2+,50μmol/LdNTP,1UTaqMan聚合酶,上下游引物各400nmol/L,200nmol/LTaqMan探针,1ng模板DNA,最终用灭菌水补足至25μL。反应程序为:95℃3min;95℃15s,60℃25s,40个循环。所有的荧光PCR检测反应均至少重复3次。1.5不同温度的测试实时荧光PCR进行两步反应,对复性-延伸温度进行了优化,分别进行了56、58、60℃和62℃4个不同温度的测试;使用GR3样品进行引物和镁离子浓度的优化,引物浓度200～2000nmol/L,镁离子浓度从0.5mmol/L到5mmol/L各11个均匀递增的浓度梯度。1.6特殊检测试验在最佳PCR反应条件下,使用上述所有的线虫群体开展引物和探针的专化性测定。1.7荧光pcr检测dna为了测试最低DNA检测域值,使用马铃薯金线虫的GR3样品从103pg到1fg进行10倍梯度稀释,直至荧光PCR反应检不出目标DNA为止,上述每个浓度均作3个重复,最后制作定量的标准曲线。单个孢囊的荧光PCR检测试验使用了全部19个孢囊线虫群体。1.8球孢囊线虫检测设计了对马铃薯金线虫、马铃薯白线虫单个样品或两者的混合样品进行检测的试验;同时对来自俄罗斯的未知球孢囊线虫进行实际检测(以马铃薯金线虫的GR3群体为阳性对照)。所有试验均采用上述最佳参数反应体系,重复3次。2结果与分析2.1计马铃薯金线虫的引种从GenBank下载所有马铃薯孢囊线虫的ITS(包括ITS1、ITS2和5.8S)序列,并进行比对分析,设计马铃薯金线虫的专化性引物与TaqMan探针。上游引物(MJTS)为5′-ACTCCATGTTGTACGTGCCG-3′,下游引物(MJTX)为5′-CACGGCCACGGACGTAG-3′;探针(MJTB)为5′-TGCGGCATGTCTGCGCTTGTG-3′,其5′端以FAM作荧光标记,3′端以TAMRA作标记。2.2生成最大n确定能得到最大的ΔRn值时的最低引物浓度和镁离子浓度,以使用最小循环阈(Ct)和最大ΔRn值来作这一优化。研究结果表明,在本荧光PCR反应体系中,最佳反应条件为:正反向引物浓度均为1200nmol/L,Mg2+浓度为3.0mmol/L,探针浓度为600nmol/L,复性-延伸温度为60℃。2.3马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的关系用TaqMan探针对14个马铃薯孢囊线虫群体和其他几个孢囊线虫进行的荧光PCR检测结果表明,来自马铃薯金线虫的8个群体都检测到荧光,而其他孢囊线虫均不产生荧光,因此特异性引物和探针能有效地将马铃薯金线虫和马铃薯白线虫及其他孢囊线虫区分开来(见图1),说明上述引物和TaqMan探针的专化性。2.4abipris荧光检测系统检测结果相关性分析将马铃薯金线虫GR3的DNA在紫外分光光度计上测其DNA的量,然后进行10倍梯度稀释和测量,结果表明线虫DNA浓度越大Ct值越小,同时能够检测的最低DNA浓度为10fg。ABIPrism荧光检测系统记录的Ct值与DNA模板浓度呈线形关系(Y=-2.428X+28.03,R2=0.993),表明检测结果的有效性,并可以用于目标DNA的定量分析。同时,对单个干孢囊进行灵敏度检测试验,结果表明从单个干孢囊中提取的DNA量足以进行荧光PCR检测,并且效果很好。2.5马铃薯金线虫的检测使用特异性探针对6个马铃薯金线虫与马铃薯白线虫的混合样品进行检测,在混合样品中也都可检测到马铃薯金线虫的存在(图2)。采用马铃薯金线虫实时荧光PCR检测体系和马铃薯白线虫实时荧光PCR检测体系(未发表)同时检测来自俄罗斯的马铃薯孢囊线虫样品,未知样品在马铃薯金线虫检测体系中产生荧光(图3),证明该未知样品为马铃薯金线虫。3荧光pcr方法的应用迄今为止,已经有许多分子技术用于区分马铃薯金线虫和马铃薯白线虫,包括RAPD、RFLP等方法。由于需要有电泳制胶的过程,上述分子检测方法还不能称为严格意义的快速检测方法。荧光PCR是在同一PCR试管内完成PCR扩增、荧光探针杂交和信号检测,不需要PCR后的电泳等工作,大大降低了污染的可能性,提高检测特异性,使得这一PCR技术准确性达到了要求最严格的法检要求。荧光PCR检测比常规的凝胶染色检测灵敏度提高百倍甚至更高,在有些检测领域已接近检测灵敏度的极限,成为最灵敏的检测方法,本研究的检测灵敏度达到10fg,为目前报道的最高灵敏度。同时,与其他分子检测技术比较,荧光PCR方法可使检测时间大大缩短,在30min～2h内完成全部检测工作,一次最多能同时检测100多个样品;而且自动化程度很高,真正做到快速、准确、灵敏和高通量。核糖体DNA的ITS长度和序列区已被广泛用于包括球孢囊属(Globodera)、斑皮线虫属(Punctodera)、异皮线虫属(Heterodera),棘皮线虫属(Cactodera)和伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus)线虫检测与群体研究,本研究中作者也是针对马铃薯金线虫的ITS序列设计检测引物和探针。2005年,Madani等设计并进行了SYBRGreenI检测马铃薯白线虫以及甜菜孢囊线虫。SYBRGreenI能与所有的双链DNA相结合,所以对不同模板不需特别定制,通用性好,并且价格相对较低。但是,SYBRGreenI由于没有特异性,不能识别特定的双链,只要是双链就会结合发光,对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光,所以与TaqMan探针相比,SYBRGreenI对反应条件要求很高,在实际使用中可能会发生假阳性。因此本研究使用的TaqMan探针检测灵敏度更高、专化性更强。此外,作者使用TaqMan-MGB探针检测松材线虫,但其成本