秋季福建色谱概论

每时每刻的挑战：混合物的分离分析2mixturePurposeAnalysisPreparationMathematically:chemometricsPhysically:extraction,chromatography,fractionation,…Chemically:tandemMS,…3色谱与中药研究中药现代化－中药质量控制中药指纹图谱中药材化学成分提取分离中药材资源及品质鉴定研究中成药及中药材有效成份的定量分析药效、药代动力学、代谢组学4课程概况理论课：36学时课序日/月星期节次教学进度授课学时授课老师17/12一6-8色谱学概论3闻俊28/12二2-5气相色谱法及其应用4闻俊39/12三6-8高效液相色谱法及其应用3闻俊410/12四1-3毛细管电泳技术3闻俊511/12五4-5现代色谱－质谱联用技术（一）2闻俊614/12一6-8现代色谱－质谱联用技术（二）3闻俊715/12二2-5色谱前处理技术4闻俊816/12三6-8制备色谱的理论与实践3赵卫权917/12四1-3高速逆流色谱及其应用3赵卫权1017/12四6-8色谱文献研读3赵卫权1118/12五4-5复习2赵卫权1228/12一6-8考试3魏艺聪合计365提取蒸馏离心过滤••••常用的分离方式色谱Chromatography

6Whyitiscalledchromatography?Tsweet(Russianbotanist)-1906Firstcoinedthetermchromatographywhichmeanscolormappingfromhisseparationofplantpigmentsoncalciumcarbonate

columns.MikhailSemenovichTsvet1872-1919

7碳酸钙色素混合液石油醚流动相(石油醚)固定相(碳酸钙)色谱柱固定相颗粒流动相Mobilephase混合物组分Stationaryphase10定义：色谱法是一种物理和物理化学的分离分析方法，其原理是利用不同物质在流动相与固定相两相中的吸附、分配等差异而导致分离。特点：能解决一般分离方法所不易解决的物理常数相近、化学性质类似的同系物、异构体、复杂多组分混合物的分离分析问题。具高灵敏度、高选择性、高效能、快速、应用范围广等特点11色谱法概论百年历史回顾基本内容发展趋势121906年，Tsweet发现色谱分离现象。色谱分离方法虽然早被发现，但令人遗憾的是这种高效分离方法被遗忘达二十几年之久，不为人们所重视。主要原因是Tsweet的论文以俄文发表在本国期刊上。

百年历史

1931年，当德国人库恩（Kuhn）、法国人莱德列尔（Lederer）等公布了他们分离类胡萝卜素的两种同分异构体文章，被遗忘了25年的色谱法，才出现复兴。131941年，Martin和Synge，分配色谱法

发明了利用物质在两种不相混溶的溶剂中因分配系数的不同而达到分离的“分配色谱法”。1952年获Nobel奖。

在研究羊毛中的氨基酸成分，把一种液体涂渍在某种细粉（称为载体）上，然后再装在玻璃管内，这样液体就固定住了，随后让第二种不相混溶的液体流过。他们以硅胶为载体，把水涂渍其上，以氯仿为流动相，结果获得了巨大的成功。

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141944年，Consden、Gordon与Martin发明了以纸代替吸附剂的“纸色谱法”。

1938年，薄层色谱法首次用作酊剂中成分的分离。1956年，Stahl系统研究了硅胶的规格、性能及薄层厚度对薄层色谱的影响。

1959年，Perflodin，空间排阻色谱法分离生物大分子。

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1952年，James和Martin，气相色谱法以气体为流动相，固定液的“气-液色谱法”

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1954年，各种检测器的出现:TCD,FID,ECD1957年，Golay，开口毛细管柱1952年，Martin和Synge，塔板理论1956年，VanDeemter，速率理论1959年，Martin等人，裂解气相色谱法PGC60年代，GC-MS商品化仪器的出现16

1965--1968年，高效液相色谱法条件：（1）高压泵的出现（2）高效微粒填充剂（3）柱分离与光学检测器Giddings和Snyder，提出液相色谱速率方程

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1981年，Jorgenson和Lukacs，毛细管电泳法使用了内径75m，100cm长的毛细管1984年，Terabe，胶束电动色谱法在CE电解质溶液中加入表面活性剂1983和1987年，Hjerten，毛细管凝胶电泳法和毛细管等电聚焦电泳1989年，出现商品化仪器18色谱法的主要应用药学研究：药物质量控制、手性药物分离、化学单体制备……食品检测：孔雀石绿、瘦肉精、三聚氰胺……刑侦法医：中毒分析，毒品筛查，兴奋剂检测……农业应用：农药残留……19色谱法的基本内容分类与分离机制

色谱参数

色谱理论

定性定量方法20色谱法电泳法气相色谱

GC超临界流体色谱SFC…液相色谱

LC平面电泳（凝胶电泳）毛细管电泳CE…柱色谱毛细管色谱-GLC平面色谱PC柱色谱毛细管色谱GSCGLC纸色谱-LLC薄层色谱TLCLSCLLC分配色谱-LLC吸附色谱-LSC离子交换色谱-IEC分子排阻色谱-SEC亲和色谱-AC毛细管电色谱CEC按流动相/固定相分类按操作模式分类21按分离机制分类吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法分子排阻色谱法22溶质分子mam

流动相

a

吸附剂吸附层Adsorptionchromatography

23吸附色谱法分离原理

利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离。吸附过程是试样中组分的分子(X)与流动相分子(Y)争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程。24Partitionchromatography流动相中的溶质分子进入固定相内部的溶质分子msm

流动相

s

固定相固定相载体25分配色谱法分离原理

利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则K越大。在LLC中K主要与流动相的性质(种类与极性)有关；在GLC中K与固定相极性和柱温有关。26+-resinbone++++-+resinbone-CationionexchangeAnionionexchange+--MPSPMPSPregenesisexchangeregenesisexchange27离子交换色谱法分离原理利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离。分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。28MPSPSizeExclusionChromatography29分子排阻色谱法

分离原理

根据被分离组分分子的线团尺寸进行分离。也称为空间排阻色谱法。渗透系数：

Kp=

Xs

/

Xm

（0＜Kp＜1

）由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙的大小所决定。在一定分子线团尺寸范围内，Kp与分子量相关，即组分按分子量的大小分离。30按两相的相对极性分类反相色谱和正相色谱反相色谱-固定相极性<流动相极性正相色谱-固定相极性>流动相极性NormalPhaseChromatographySPPolarity>MPPolarityReversedPhaseChromatographySPPolarity<MPPolarity31色谱参数*定性参数*柱效参数*分离参数*相平衡参数32定性参数---保留值保留时间(tR)：从进样开始到某个组分的色谱峰顶点的时间间隔。死时间：(tm或t0)：在色谱过程中，不保留组分的保留时间。调整保留时间(t’R)：扣除死时间后的样品保留时间。t’R=tR-tm保留体积(VR)；死体积(Vm或V0)；V’R

33Chromatographicelutioncurve/Chromatogram

signal

retentiontime;tRretentionvolume;VRdeadtime;t0(tM)deadvolume;V0(VM)adjustedretentiontime;tR’adjustedretentionvolume;VR’relativeretention;r(=α)retentionindex;I34柱效参数标准差()：正态分布曲线两拐点间距离的一半(相当于0.607h处峰宽的一半)峰宽(W)：过色谱峰两侧拐点作切线，在基线上的截距为峰宽半峰宽(W1/2)：峰高一半(0.5h)处的峰宽

W=4=1.699W1/2W1/2=2.355理论(塔)板数(n)和板高(H)35Chromatographicelutioncurve/Chromatogram

signal

retentiontime;tRretentionvolume;VRdeadtime;t0(tM)deadvolume;V0(VM)adjustedretentiontime;tR’adjustedretentionvolume;VR’relativeretention;r(=α)retentionindex;I

standarddeviation;σpeakwidthathalfheight;W1/2hpeakwidth;W36分离参数----分离度(R)分离度：用以衡量相邻峰的分离情况R=2(tR2-tR1)W1+W2定量分析时，应使R1.53738

相平衡参数*分配系数

K=CsCm组分在固定相中的浓度组分在流动相中的浓度K与组分、固定相、流动相性质和温度有关。K大，样品移动速度慢，K小，移动快。tR’t0=KVsVmk与组分、两相性质和温度有关，还与两相体积有关K或k不等，是分离的先决条件*容量因子k=WsWm=KVsVm40RetentiontimePartitioncoefficientThermodynamics(phaseequilibrium)Platetheory(Martin&Synge)ColumnefficiencyPeakwidthKinetics(processkinetics)Ratetheory(VanDeemter)RESOLUTION塔板理论速率理论41塔板理论

始于马丁（Martin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸点不同而分离。色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡，按分配系数不同而分离。42塔板理论—热力学理论

基本假设①在柱内一小段高度H内，组分可以很快在两相中达到分配平衡。H称为塔板高度②载气通过色谱柱不是连续前进，而是间歇式的，每次进气为一个塔板体积③样品都加在0号塔板上，样品沿色谱柱方向的扩散可以忽略④分配系数在各塔板上是常数43S0M0S1M0S2M0S0M1S1M1S0M2.8A+.5B.2A+.5B.16A+.25B.04A+.25B.032A+.125B.008A+.125B.64A+.25B.16A+.25B.256A+.25B.064A+.25B.512A+.125B.128A+.125BM0+freshS1M0+freshU2S0+freshM1S0+freshM1S1+M1Step2Step1Step0Plate0Plate1Plate2KA=4,KB=1[I]sp[I]mpKI=44Step7Step5Step1Step345TableFractionofsoluteineachplateaftereachadvanceStepNoPlateNo,r012345671qp2q22pqp23q33pq23p2qp34q44pq36p2q24p3qp45q55pq410p2q310p3q25p4qp56q66pq515p2q420p3q315p4q26p5qp67q77pq621p2q535p3q435p4q321p5q27p6qp7………………………………………………*:p=fractionsoluteinSP[ms],q=fractionsoluteinMP[mm]46理论(塔)板数(n)和板高(H)的计算H=L/nn或H，柱效n=()2=5.54()2=16()2tR

tRtRW1/2W47塔板理论解决的问题：1流出曲线的形状2浓度极大点的位置(tR)3评价柱效高低塔板理论的缺陷：由于基本假设与实际的不相符，使之不能解释板高受哪些因素影响，不能说明为什么在不同流速下，可以测得不同的理论塔板数这一实验事实48BandBroadening49速率理论(VanDeemter方程)1956年，荷兰学者范第姆特(VanDeemter)提出了色谱过程动力学理论——速率理论。塔板高度涡流扩散项纵向扩散项传质阻抗项H

=

A

+

B/u+

Cu50BandBroadening:EddyDiffusion

涡流扩散51BandBroadening:LongitudinalDiffusion

纵向扩散52涡流扩散项A(多径扩散)

A=2dp填充不规则因子填充物平均直径纵向扩散项B/u(分子扩散)

B=2Dg弯曲因子,与填充物有关填充柱<1,空心毛细管柱=1组分在载气中的分子扩散系数载体适当细粒度、颗粒均匀增大载气分子量或线速度空心毛细管柱A=0packingirregularaverageparticlediameterobstructionfactordiffusioncoefficientofsoluteinthemobilephase53BandBroadening:ResistancetoMassTransfer

传质阻抗54传质阻力项CuC=Cg+ClCl=2kdf23(1+k)2Dl固定液液膜厚度组分在固定液中的扩散系数df小，Dl大，C就小55LC中Giddings液相色谱速率方程式H=A+B/u+(Cm+Csm+Cs)uH=A+(Cm+Csm+Cs)uH=A+(Cm+Csm)u5657色谱法的定性定量分析58定性分析1利用保留值定性与对照品比较①tR(样)=tR(对)②增加峰高

相对保留值(相对保留时间)r1,2=t’R1/t’R2未知物标准物

求保留指数，与文献值对照2两谱联用定性GC-MS，GC-FTIR等59常用的定量方法峰面积百分比法常用于有关物质的测定外标法在液相色谱中用的最多内标法准确，但是麻烦在气相色谱中用的最多外标法定量配制一系列已知浓度的标样外标法定量实际色谱图标准曲线内标法定量（一）配制一系列浓度的标样，其中加有内标样内标法定量（二）标准曲线特点：无需各组份都被检出、洗脱需要标样，需要内标样结果与进样体积无关65色谱法的发展生物色谱法中药色谱指纹图谱66生物色谱法

(Biochromatography)80年代中后期，生命科学与色谱分离技术交叉将活性生物大分子、活性细胞膜、甚至活细胞固着于色谱担体上，作为一种生物活性填料，用于液相色谱法，形成一种能够模仿药物与生物大分子、靶体或细胞相互作用的色谱系统，表征药物与生物大分子、靶体间的相互作用。中科院大连化学物理研究所邹汉法、西安交通大学贺浪冲、南京中医药大学国家规范化中药药理实验室67

对于中药等成分复杂的研究对象，生物色谱法由于固定相能够特异性、选择性地与活性成分结合，可以排除大量非作用杂质成分的干扰，是研究中药等复杂对象的有效手段。

药物在生物色谱柱上的保留行为直接与其活性或与生物大分子、靶体、细胞结合相关，具有一定的药理学或生理学意义；68分子生物色谱法(MolecularBiochromatography)仿生物膜色谱法(ArtificialBiomembraneChromatography)生物膜色谱法(Biomembranechromatography)细胞生物色谱法(CellBiochromatography)69例

邹汉法等以血浆中两种主要的载体蛋白：人血清白蛋白(HSA)和α-酸性糖蛋白(AGP)为固定相，对常用中药当归、川芍、茵陈、黄芪、赤芍、银杏叶、丹参等进行了分析

分子生物色谱指纹图谱，用于快速鉴别中药材及其提取物

快速筛选中药活性成分

中药活性成分在HSA、AGP柱上的保留行为直接与各成分的血浆结合率相关70SeparationoffourkindsofChinesetradltionalmedicineontheHSAcolumn(A)当归(B)黄芪(C)赤芍(D)川芎流动相：乙腈：50mmol／Lphosphatebuffer(pH7.4)15:8571例

贺浪冲研究细胞膜色谱法（CellMembraneChromatography，CMC），以冠状动脉细胞膜、心肌细胞膜、血管细胞膜、大脑细胞膜等作为固定相，对常用中药丹参、人参、白芍及其方药等中的有效成分进行了筛选.72

Immobilizedliposomechromatography(ILC)isregardedasapowerfultooltostudydrug-membraneinteractionsinLC.

Liposomeformedbyphosphatidylcholine,themaincomponentsfoundincellmembrane,wasnoncovalentlyorcovalentlyimmobilizedonthesilicaparticlesaschromatographicstationaryphase.CellmembraneStationaryphase脂质体柱73五味子提取物在脂质体柱上的分离74全二维色谱分离五味子提取物Three-dimensionallandscapeimagesTwo-dimensionalcontourplot75中药指纹图谱技术水平较低，现代技术应用少。参差不齐，许多十几年未变。中药质量标准无法说明发挥药效的化学成分的数量和含量，也无法保证每批中药的成分一致性（稳定性），国际未接受。体系存在缺陷，无法被国际认可,亟待提高和发展76一、背景——中医药特色与优势为中华民族的繁衍作出了巨大的作用。公共卫生资源充分发挥作用；在国家初级保健系统中的重要地位。降低了疾病发生率，提高了公众的生命质量，特别是在治疗慢性病、养生保健等有优势。新药研发费用远较化学合成药物为低。77传统中药的不足研究开发体系不完善生产不规范和规模小国内外认可程度不高78中药现代化的关键问题理念:将传统中药的优势特色与现代科学技术相结合，按照国际规范进行研究、开发、生产、管理和使用。原则：保持中医药优势特色；与现代科学技术充分结合；具备国际认可的标准规范。核心:保证中药质量的稳定和可控，提升中药药效、减少毒副作用。79四性的核心是标准。质量标准的现代化是中药现代化的瓶颈，处于优先解决的战略问题。指纹图谱是以现代分析技术为依托的是一种新的质控模式，是增加一种中药特有的分析内容。

80现行中药质量控制模式借鉴化学药品质量控制的模式人参皂苷Rg1+Re不得少于0.25％，而人参叶规定Rg1+Re不得少于2.25%。粉葛中规定不得少于0.3％，而野葛则不得少于2.4％81现行中药质量控制模式的局限性借鉴化学药品的质量控制模式，靠天然药物化学的发展。建立以测定某单一成分为目标的分析方法和既定性又定量的质量标准。单一化学成分分析的观点，与中医理论的“整体”观相悖。化学药──单一成分，单一靶点中药──多成分，多靶点，非线性多元交互82化学药是由成分已知、数量有限、含量确定的化合物组成。中药药效学的物质基础是有效化合物群，中药是内含部分未知，数量无限、含量难确定的化合物组成。西药是一白色体系，中药是一灰色体系。83新分析方法的产生指纹图谱技术以现代分析技术为依托的指纹图谱分析技术是用代表中药药效学物质基础的化合物群所表征的图谱来综合评价中药质量。符合中医理论和中药化学成分的特点，能较全面地反映中药质量的本来面貌，也符合国际药品质量控制的理念。指纹图谱技术是建立现代中药质量标准的核心和基石之一。84目前的指纹图谱研究手段主要是色谱法和光谱法。包括薄层色谱(TLC)、气相色谱(GS)、高效液相色谱(HPLC)、超临界流体色谱(SFC)、高效毛细管电泳色谱(HPCE)；紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、核磁共振谱(HMR)、质谱(MS)、扫描电镜指纹谱(SEM)、X射线指纹谱(XRD)；DNA指纹谱采用多种现代分析仪器联用方式得到的多维多信息特征谱等。

85

建立符合中医药特色的质量标准体系，逐步由指标性成分向活性成分的测定过渡，由单一成分向多个成分测定和指纹图谱整体控制模式的转化。2005年版中国药典设计方案目标之一861990年版药典：对照药材2000年《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》（暂行）2002年《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南》（试行）关于《中国药典》2010年版的主要工作完善主要检查方法应用指导原则，如“注射剂安全性检查指导原则”、“中药指纹（特征）图谱技术指导原则”、“发酵产品及半合成产品杂质控制的指导原则”、“生产过程质量控制分析方法指导原则”等

增订药品命名原则，修订“药品稳定性试验指导原则”等，增订晶型控制的指导原则增订血液制品病毒灭活技术指南、生物制品生产用牛源性原材料的管理要求等87二、中药指纹图谱相关概念1.定义：运用现代分析技术表征和评价具有代表性中药化学成分群信息。“现代分析技术”指：光谱、色谱、波谱、联用技术，以及化学计量学和计算机技术等。“中药化学成分群”指：药材、饮片、中药提取物和成药中与药理活性相关的，由次生代谢产物组成的化合物群。88“代表性”指：中药化学成分群信息须具有统计学意义的样本数，以保证建立的标准成分考虑中药的生产，以及安全、有效和稳定。“表征”指：将化学成分群信息通过一定的分析方法所获得的图谱。“评价”指：通过相关技术参数，经过信息处理、化学计量学和计算机技术等过程，对表征图谱进行数字和智能评判。指纹图谱具有整体、专属和模糊性。892.指纹图谱的制定原则指纹图谱作为中药质量标准的分析项目之一，依据药品应具有安全性、有效性、稳定性和可控性的要求，应符合系统性、特征性、稳定性的原则。体现三原则，才能保证药品四性。90系统性是指图谱所反映的化学成分全部信息，其中包括中药有效部位所含主要成分的种类，或指标成分的全部。特征性是指图谱中反映的化学成分信息是具有高度选择性的，这些信息的综合结果，将有助于特征区分中药的真伪与优劣。稳定性指的是所建立的指纹图谱，在规定的方法与条件下，不同的操作者和不同的实验室应能作出相同的指纹图谱。91药材herbs中药制剂Preparations现代中药质量标准体系MordernQuanlityStandardSystemofTCM饮片decoctionpieces提取物extrations中药指纹图谱（核心技术）TCMfingerprinting

中药质量检测平台QualityplatformofTCM３.现代中药质量标准体系92４.国内指纹图谱技术发展状况1）普遍达成共识，认为对中药质量控制具有全面性、完备性和普遍性。2）标准研究和技术走在国际前列。3）国内相关研究单位，包括药典会、高校科研院所、中药生产单位等建立了一个非常实用、科学的技术平台，是一个飞跃。4）培养了一支队伍。5）注射液已完成了解、协调工作，统一标准工作在有序展开。6）发展了理论，积累了经验。93５.指纹图谱的地位作用注射剂用中药材指纹图谱研究的技术要求中药注射剂及其有效部位或中间体指纹图谱的检测标准不可能弄清全部成分的中药可以在不要求搞清的前提下建立分析用整体指纹图谱综合和特征评价质量目的保证中药的稳定性和可控

94中药材预处理中药液相色谱分析条件分离色谱条件初始化指导方法学考察指纹图谱调整色谱条件N其他1.计算机辅助指纹图谱评价2.多成分定量分析方法建立６.色谱指纹图谱平台流程95７.指纹图谱的关键环节1）图谱获取：保证图谱全面、稳定和重现，获取规范化。2）图谱解析数字化。3）评价信息化和计算机化。96

中药提取、分离色谱、光谱及多维联用中药指纹图谱信息处理聚类分析相似度判定信息挖掘药效活性研究谱效学研究化学计量学药物信息学鉴别质量控制三、指纹图谱的获取规范化97指纹图谱获取Acquisition有效组分提取分离分离分析条件优化多维多息化学指纹图谱信息获取与融合

多维联用分析活性成分分析鉴定１.指纹图谱获取的影响因素98中药材、中药制剂提取分离常规提取分离方法超临界流体萃取超声、微波提取漩流、半仿生提取全自动多溶剂提取色谱分离，固相萃取双水相分离样品无机离子有机小分子生物大分子ICICPICP/MS挥发性组分非极性组分中极性组分强极性组分IR,GC,HPLC,CE,TLC,GC/MS,HPLC/MS,HPLC/DAD/MS/MS,HPCE/MS,ICGPCCEESI/MS色谱指纹图谱的分析方法策略99３.方法学验证Validation

专属性（specificity）精密性（precision）

保留时间精密度峰面积精密度重复性（repeatability）

保留时间重现性峰面积重现性稳定性（stability）线性（linearity）耐受性（robustness）参照物检出限（LOD）100多维、联用等分析Analysis药效检测pharmacology信息处理Informationprocess中药药效组分指纹图谱中药指纹图谱发展趋势质量表征和评价Qualityevaluation新药研发R&DofDrugs质量控制Qualitycontrol指纹图谱获取Acquisition方法学验证Validation指纹图谱应用ApplicationFunctionalfingerprintingofTCM

101中药指纹图谱数据库中药材指纹图谱中间体指纹图谱中药制剂指纹图谱不同产地不同采收期不同炮制方法不同药用部位不同处理方法不同炮制方法不同产地原料不同工艺条件中药指纹图谱库标准指纹图谱库

高维指纹图谱库编码技术等102中药指纹图谱分析示例103建立对照指纹图谱用于建立对照指纹图谱的样品图谱104生成的对照图谱生成的对照图谱（平均值法）105样品检查样品检查相似度评价结果106色谱指纹图谱应用示例107知母为百合科植物知母(AnemarrhenaàsphodeloidesBge.)的干燥根茎，为常用中药主要成分为皂苷类，黄酮类，木脂素等芒果苷和新芒果苷是其清热作用的有效成分１.知母的指纹图谱研究108色谱条件色谱柱：Hypersil填料，C18-ODS柱（5μm，4.6×250mm，大连依利特）；流动相：采用梯度洗脱，A相为乙腈，B相为25mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH3.0）；流速：1.0ml/min，运行时间60min，检测波长257nm，柱温为25℃。梯度程序：Time(min)%A(ACN)%B(buffer)0010020100589220892321585507030109溶液制备供试品溶液药材粉末0.2g80%甲醇25ml超声20min过滤残渣80%甲醇25ml滤液过滤超声20min滤液合并滤液挥干，甲醇定容至25ml110分离时间图知母样品120min色谱图111指纹图谱稳定性考察色谱峰的峰面积112色谱峰的保留时间113对照品及样品色谱图(A)(B)图1对照品(A)及样品(B)HPLC色谱图,1-新芒果苷，2-芒果苷114不同产地知母药材的HPLC指纹图谱115不同产地知母药材的对照指纹图谱样品对照指纹图谱116检测波长的选择原则与思路：对于各种有效成分研究得比较透彻，药效成分已知的中药，应选择药效成分的最大吸收波长为检测波长；对于有效成分还不明确和未知的中药，应选择色谱峰出峰数目最多的检测波长。220nm：相似度好，未体现指标成分280nm：相似度差257nm：相似度和指标成分均符合技术要求117特征波长指纹图谱将色谱图上的每个主成份（共有峰）的响应信号取其在紫外最大吸收波长处的吸收信号，然后对得到的综合了不同波长的检测信息的指纹图谱进行相似度计算和评判。118２.淫羊藿药材指纹图谱研究1.淫羊藿样品前处理方法粉碎过筛称定0.2g70%乙醇20ml密塞超声30min补足失重离心过滤棕色容量瓶冰箱冷藏1192.HPLC色谱方法

色谱柱：迪马Diamonsil-C18柱（5μm，4.6×250mm）流动相：乙腈，纯化水（以甲酸调pH至3.0），梯度洗脱流速：0.9ml/min，采集45min内色谱图；

DAD检测检测波长：270nm；进样量：20μl。时间（min）03