常用细胞培养技术 培养细胞的污染及控制

培养细胞的污染及控制2023/10/2712023/10/2722023/10/27污染：是细胞培养的大敌培养成功的关键之一：预防和避免污染

22023/10/2732023/10/27一、污染的类型细胞培养过程中的污染不仅指微生物；而且包括对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。2023/10/2742023/10/271、细菌污染常见的污染，即使加抗菌素(一般为预防剂量)，也会因操作不慎而污染。细菌污染后，培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、变圆、脱落死亡。有的培养液肉眼观察无改变，只在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。2023/10/2752023/10/272、真菌污染最常见一种污染，在霉雨季节更易污染。污染表现：肉眼：漂浮白色或浅黄色小点，一般不混浊；显微镜下:培养瓶用酒精棉擦试，防止与瓶外菌丝混淆可见丝状、管状、树枝状菌丝交错存在。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞间。后果：生长变慢，最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。2023/10/2762023/10/273、支原体污染支原体：介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物最小直径0.2μm，过滤除菌无效，光镜下看不清。在偏碱条件(pH7.6～8.0)生存，对青霉素有抗药性多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。后果：部分：生长增殖变慢；部分：变圆，从瓶壁脱落；多数：无明显变化，或略有变化。2023/10/2772023/10/274、病毒污染是细胞生产和疫苗、干扰素等生物制品生产中的难题。后果二倍体细胞系混有SV40或多发瘤病毒B淋巴细胞含EB病毒=>细胞核会发生变异、转化，形成异倍体细胞系。2023/10/2782023/10/275、非同种细胞污染细胞培养时各细胞株所用器材和溶液未严格分开，操作不当，使一种细胞被另一种细胞污染。如“灵长类”细胞系中发现猴和鼠类细胞的混合物；ERK/KD细胞是从兔肾中分离出来的，而现在却认为是HeLa细胞。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。2023/10/279非细胞培养物造成的化学成分的污染：

大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。2023/10/272023/10/27102023/10/27二、污染来源1、不洁的动物组织标本很多动物组织无菌(直接与外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系统除外)，但取材时不小心造成污染。组织本身含有细菌，如取材时不用浓的抗生素洗液洗涤浸泡，也会带菌，造成细胞污染。2023/10/27112023/10/272、空气（含大量细菌）操作室与外界隔离不严或消毒不充分；超净台使用过久，滤板长久不换，尘埃堵塞滤器；工作时不带口罩或外界气流过强，污染空气进入操作区；多雨季节，空气湿度大，含菌量多，工作不注意。2023/10/27122023/10/273、清洗消毒培养用物品、材料洗刷不净培养用液和器材灭菌不彻底引入微生物和有毒物质。2023/10/27132023/10/274、操作器材和溶液使用前未消毒灭菌，时隔已久未重新处理。未戴口罩、帽子，呼出气中排出细菌和支原体。培养瓶口未用75%酒精擦/烧灼。吸管或无菌器具碰到了污染的物品，如手和瓶子外壁等。大声说话，来回走动扬起灰尘等。2023/10/27142023/10/275、血清市售血清灭菌不彻底，潜在病毒和支原体污染。2023/10/27152023/10/27三、污染的清除污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之。若污染细胞价值较大，难于重新得到，可采取以下办法清除。2023/10/27162023/10/27使用抗生素对细菌有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素(青霉素100u/mL加链霉素100μg/mL)，污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍的冲洗法，加药后作用24～48小时，换常规培养液。2023/10/27172023/10/27加温处理41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。处理前：预试验摸索能最大限度杀死支原体，又对细胞影响最小的加热时间。若先用药物处理，再以41℃加温处理