连黄对大肠埃希菌多重耐药基因acramrna表达的影响

连黄对大肠埃希菌多重耐药基因acramrna表达的影响

现在，通过提高细菌膜外输出泵的生产水平，可以主动将药物或其他外离出冒出细菌细胞的污染物释放到细菌细胞，从而获得细菌非特异性耐药性。大肠杆菌(Escherichiacoli)是畜禽的重要致病菌,也是发现外输泵最多的细菌,现已发现了约30种外输泵。一般认为AcrAB-TolC是大肠杆菌主要的外输泵。本试验用中药复方制剂连黄(精提,粗提)作用于多重耐药大肠埃希菌,应用实时荧光定量PCR法对中药连黄(精提,粗提)作用前后AcrA基因的mRNA表达水平进行了对比分析,检测复方中药对大肠埃希菌耐药性的影响与AcrA基因的mRNA表达水平的关系,为中药制剂的全面开发及临床应用提供理论依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1病毒敏感大肠埃希菌K88由韩国国立兽医科学检疫院提供,耐药大肠埃希菌NUT及多重耐药大肠埃希菌DL1由延边大学农学院药理实验室提供。1.1.3ker研究项目主要试剂TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000Marker购自宝生物工程(大连)有限公司;总RNA提取试剂盒、TaKaRaRNAPCRkit(AMV)Ver.3.0反转录试剂盒等为宝生物工程(大连)有限公司和北京华美公司共同提供。1.1.4实时荧光定量pcr设备主要有T1PCR仪(德国Biometra公司)、GeIDoc-IT数字凝胶成像分析系统(美国Sim公司)、3-18k低温高速离心机(武汉力博远志科技有限公司)、Y1-1450-1S无菌超净工作台(山东济南天方净化设备工程公司)、UV-722可见光分光光度计(上海亚研电子科技有限公司)、Ling-gene实时荧光定量PCR仪(杭州大和热磁电子有限公司)等。1.2测试方法1.2.1引物的引物从GenBank中查到大肠杆菌AcrA基因的序列,借助计算机软件设计一对引物,引物由上海英骏生物有限公司合成。上游引物为:5′GACGACAAACAGGCCCAACA3′,下游引物为:5′TTAAGACTTGGACTGTTCA3′。以提取的多重耐药大肠埃希菌的质粒作为模板进行PCR扩增,将扩增产物纯化,把回收的PCR扩增目的片段与pMD18-T载体连接,转化DH5α感受态菌,进行蓝白斑筛选阳性克隆、HindHI和EcoⅠ酶切鉴定,同时进行PCR鉴定。1.2.2在中药复方制剂的作用前后，acra总nale活性物质的制备根据TaKaRaRNAPCRkit(AMV)Ver.3.0反转录试剂盒的说明书提取大肠杆菌的总RNA,进行反转录。1.2.3不同碱基绝对模板数量已知pMD18-T载体长2692bp,插入的AcrA片段长为1005bp,每个碱基的相对分子质量为330bp,阿弗加德罗常数为6.02×1023/mol。通过公式计算出每2μL的绝对模板数量(质粒含量)是1.5×1017。每个样品分别设2个重复,取等比10倍稀释的标准品1μL进行荧光定量PCR反应。1.2.4fluo-pcr和上、下游pcr的配比利用所设计的引物对参考模板和待测的靶序列进行实时荧光定量检测。体系如下:HotstartFluo-PCRmix混合物25μL,上、下游引物各1μL,模板1μL,用去离子水补至50μL。条件:94℃预变性3min,94℃变性30s,60℃退火45s,72℃延伸1min,40个循环。2结果与分析2.1pc的目的片段提取的大肠杆菌质粒DNA经PCR扩增,得到了大小为1005bp大小的目的片段;筛选出阳性克隆菌进行酶切及PCR鉴定,由上海生工生物工程技术服务有限公司测序,结果表明,得到的碱基序列完全正确(图1)。2.2测试对象序列的制备对提取的耐药大肠杆菌总RNA进行反转录,将反转录的cDNA进行PCR扩增,均可见到1005bp大小的特异性片段,说明反转录成功。2.3确定ct值选取相当于1.5×1011、1.5×1012、1.5×1013、1.5×1014、1.5×1015、1.5×1016拷贝/μL6个浓度梯度的质粒DNA液制备标准曲线,扩增结果见图2。调整阈值和基线的配比,确定CT值,经转换得出标准曲线,横坐标为标准大肠埃希菌浓度的log值,纵坐标为Rea1-timePCR测得的CT值。斜率为-2.516,截距为39.390,将测得的CT值代入公式,可以计算出待测样品中的拷贝数。对相关系数达到0.998以上的可以作为检测的标准。由图中可见,所选的标准浓度呈现出良好的S型扩增曲线,表明各浓度梯度均可在35个循环前获得较好的扩增结果,且产物特异性强,产物的Tm值非常均一,说明引物的灵敏度高,其反应性完全可以满足进行SYBRGreen实时荧光定量PCR的要求。2.4中药复方制剂对大鼠埃希菌的作用根据标准曲线方程,可得待测模板的cDNA量,结果见表1。由表1可知,中药复方制剂连黄(精提、粗提)作用后,大肠埃希菌多重耐药基因AcrA的mRNA表达量均有所降低,与作用之前比均差异显著(P<0.05),且精提制剂降低的程度更明显,与粗提制剂相比,差异极显著(P<0.01)。3中药复方制剂连黄后样品的测定1)实时荧光定量PCR是在常规PCR方法基础上建立起来的一种分子生物学检测方法,它融汇了PCR灵敏性和光谱技术精确性的特点,是基因表达分析最常用的方法之一,其包括了绝对定量和相对定量。本研究采用绝对定量的方法,把待测基因克隆到pMD18-T载体上,该载体结构稳定、定量准确,并且制备方便、价廉,可以得到样本中基因的拷贝数和浓度。试验采用倍比稀释方法制备的标准曲线,最大程度地保证了标准品和待测样品的同一性,使结果准确可信。2)本研究通过对中药复方制剂连黄作用前后各大肠埃希菌多重耐药基因AcrA的mRNA表达量进行比较分析后可知,经中药复方连黄亚抑菌浓度作用后的大肠埃希菌多重耐药基因AcrA的mRNA表达量,均低于其相对应的中药作用前AcrA的mRNA表达量,并且精提制剂的降低程度更明显。3)大肠埃希菌产生多重耐药性主要与AcrAB外排系统有关,AcrAB外排系统包括3个成分,分别是周质融合蛋白AcrA、外排转运子AcrB和多功能外膜蛋白TolC。3个成分通过协调配合,主动将菌体内的抗菌物质泵出细胞外;如果使该系统失活,则菌株即从多重耐药状态转变为敏感状态。因此抑制AcrAB外排系统的活性或降低其表达水平,均可使细菌对环境的适应能力及抗生素耐药水平下降。本试验说明,中药复方制剂连黄(精提、粗提)的抑菌作用可能是通过降低AcrAB外排系统