中药方剂整体药效评价与多靶点作用机制研究

中药方剂整体药效评价与多靶点作用机制研究

1中药统一疗效评价标准的建立现在，全球制药行业面临着前所未有的挑战。自1991年以来，全球制药行业通过增加投资来降低许可证发放的药物数量。这一反常现象引发了人们对于当前“单成分、单靶点”药物研发思想的深入反思。由于多数疾病如癌症、糖尿病、心血管疾病、关节炎、神经精神系统疾病等均属于多基因病变,以及生物体具备强大的代偿能力通过单一成分阻断特定特异单一靶点通常难以达到理想的治疗效果。近年来,新药创制中投入/产出比的急剧降低预示着“单成分、单靶点”药物研发之路将越走越窄,取而代之的,多靶点药物(包括单成分、多靶点和多成分、多靶点)的药物研发策略将成为未来制药行业的主流。中药方剂是中医临床治疗的主要形式和手段,是在“辨证立法”的基础上通过配伍组方形成的“有制之师”。中药方剂通过其所包含的多组分发挥多途径、多靶点的协同、有机整合药效作用,从而在慢性、多基因复杂疾病中体现出优于单成分、单靶点药物的疗效优势,这一点已经得到中西方学术界的公认。在单成分、单靶点药物研发策略正面临前所未有挑战的背景下,近年来西方学者也开始重视解读传统医药思想的奥妙。然而,关于中药方剂在疾病治疗中的疗效优势仍然有诸多质疑之声。事实上,到目前为止,中药方剂的疗效优势大多数仍然仅是来源于临床经验的总结和判断,尚缺乏充分的科学依据。关键问题在于,当前应用单成分、单靶点化学药物的药效评价方法与体系,无从体现中药方剂多组分、多靶点的综合整体疗效优势。就特定药效指标而言,中药方剂所表现出来的作用通常不如相应的化学对照药物,尽管可以通过多指标体系对中药方剂的药效作用进行描述,但中药方剂对特定病证的整体疗效优势不能通过多个“弱效应”的简单加和来体现。因而,建立符合中药方剂自身特点、能够科学表征其整体疗效的药效评价体系,揭示其多组分、多靶点协同整合作用机制,是中药方剂关键科学问题研究的重中之重。继基因组、转录物组、蛋白质组、功能蛋白质组学之后,代谢组学的诞生构成了系统生物学的完整拼图。从DNA、mRNA、蛋白质到代谢产物,系统生物学可在细胞、组织、器官及整体层次研究生命活动的全过程,其中的代谢(物)组是生物体所有基因、蛋白功能活动的终点,因而代谢组被视为生物体整体功能状态的“生化表型”,能够即时、灵敏、真实表征在各种外界因素刺激下生物体整体功能状态的应答与调节。代谢组的这一特点,决定了其在中药方剂多组分、多靶点整体药效作用评价中的突出优势。近年来,国内外众多学者应用各种代谢组学研究技术,在中药整体药效作用评价研究中进行了有益的探索,本文试在扼要概述最新研究进展的基础上,结合本课题组的实践研究经验,分析当前代谢组学在中药整体药效评价研究中存在的问题,并展望今后的发展方向。2中医证质与代谢组学研究及评价中医诊断和治疗疾病的特色是“辩证施治”,通过“望、闻、问、切”来认识机体的整体功能状态改变,在临床谴方用药中强调“方证对应”的思想,对于现代西医诊断的同种疾病,中医“辨证不同”,则选方用药亦不同。因而,在进行中药方剂药效评价时,应当考虑方剂所对应的中医病证,建立相应的中医证动物模型。然而,由于中医是在人类历史长河中基于临床经验总结和升华的一门科学,缺乏实验动物研究经验的积累。尽管在实施中医药现代化研究以来,国内已有诸多学者尝试中医证动物模型的建立与评价研究,但目前对于中医证动物模型的评价而言尚缺乏公认的技术方法与指标体系。作者认为,建立中医证动物模型的科学评价体系,以沟通动物模型与相应证候临床病人的相关性,科学评价所建动物模型对于相应临床证的代表性是中医证动物模型研究的基础。目前,关于中医证动物模型评价的方法主要是基于动物的外在表现包括毛色、体重、精神状态等以及现代西医学的诊断指标进行动物模型与临床病人的关联分析。显然,由于人与动物的巨大行为差异,不太可能通过“望、闻、问、切”等手段对动物模型的“证候”进行类似临床的诊断分析,而中医证与现代西医诊断指标之间的不确定性关系,导致难以基于病理、生化指标进行中医证的评价。中医辨证是基于“有诸内必形诸于外”的思想,通过“望、闻、问、切”等手段获得对人体整体功能状态的认识,而正如前文所述,代谢组学是生物体整体功能状态的“生化表型”,可以用来表征中医思想中的“诸内”,因此作者认为中医思想与代谢组学思想是“外与内”的结合,代谢组学研究对于诠释中医证的科学本质具有重要意义。基于这一思想,本课题组率先开展了中医临床高血压辨证分型的代谢组学研究工作,通过GC/MS、GC-TOF/MS代谢组分析及主成分分析、马氏距离法等模式识别方法,发现痰湿雍盛、肝阳上亢及阴虚阳亢三种证型可被较好地区分,并通过证型相关生物标记物群的分析初步揭示了相应证型的科学本质,证明了代谢组学研究手段在中医证本质研究中的可行性。代谢组学技术在中医临床辨证分型及证本质研究中的成功应用,提示在建立人与相应实验动物代谢组相关性的基础上,代谢组学研究技术将成为中医证动物模型评价及与人的桥接和关联研究的重要手段。近年来,国内学者已开展了一些基于代谢组学研究进行中医证动物模型的评价研究工作,取得了喜人的研究成果。例如,李林等通过声、光、电刺激造成气虚血瘀证大鼠,基于核磁共振代谢组学研究技术,发现尿液中肌氨酸酐、α-酮戊二酸、柠檬酸、牛磺酸、琥珀酸等成分的含量发生了显著变化,提示与肾功能和三羧酸循环异常相关。罗和古等通过慢性束缚应激造成肝郁脾虚大鼠模型,代谢组学研究发现血浆中醋酸、乳酸、酪氨酸、低密度脂蛋白等变化显著,且发现主治肝郁脾虚证的经典方剂“逍遥散”对这些异常的代谢终产物有明显的调节效应。Zhao等研究发现心迪软胶囊可使急性血瘀大鼠尿样生化代谢谱趋向到正常状态,相关的生物标记物包括胆酸、苯丙氨酸和犬尿烯酸。针对代谢组学研究技术在中医证动物模型评价及“方证对应”研究领域中的应用,我们提出以下研究策略:(1)在中医理论指导下,探讨建立病证结合动物模型的方法,应用代谢组学的方法进行分型和评价,寻找潜在的生物标志物群;(2)用代谢组学方法对临床患者进行诊断分型,结合中医诊断结果,寻找与各个证相关的特征生物标志物群,建立客观的诊断体系,探索不同证候的体内代谢差异和其内在本质;(3)对动物模型的潜在标志物群和临床相应病证的标志物群进行桥接研究,以确证动物模型的合理性与代表性,并基于代谢组学的桥接研究结果,对相应证型动物模型的复制方法进行修正,最终建立具有与临床证型相关性、代表性的中医证动物模型,为“方证对应”的实验研究奠定基础;(4)针对临床经典和具有代表性的“方证对应”方剂同步开展实验动物模型及临床病人的代谢组学研究,分析药物调节的生物标志物的生物学作用及其所在代谢通路、代谢调控等信息,并结合经典的药效/疗效评价指标体系,阐明中医“方证对应”的科学本质(图1)。3银杏提取物对大鼠体内代谢的影响尽管“方证对应”是中医临床谴方用药的重要思想,但在现代实验研究中,大多数都是在西医病症模型中开展相关中药方剂的药效评价研究工作。作者认为在生物学背景及病理机制清晰的实验动物模型中开展中药方剂的代谢组学药效评价工作,有利于深入揭示中药方剂相比于化学药物的整体药效作用优势,并利于与经典药效研究方法相结合揭示中药方剂的多组分、多靶点作用机制,同时通过多组分中药干预的代谢组学研究还有利于深化对特定病症发病机制的理解。因此,基于中医证动物模型的“方证对应”研究与基于西医病症模型的现代中药药效与作用机制研究二者互为补充,对于深入揭示和理解中药的整体药效作用与机制研究而言均是不可或缺的研究模式。针对中药及方剂对现代西医病症模型的干预作用的代谢组学研究,国内外已有多篇研究报道。蒋宁等基于NMR的代谢组学研究技术,针对六味地黄丸及八味地黄丸对快速老龄化小鼠模型(SAMP8)的干预调节作用进行了研究,发现二者均能够有效调节SAMP8的血清代谢组,对葡萄糖、胆碱和脂类等生物标记物群的改善作用,提示二者可改善SAMP8的能量代谢障碍及学习记忆能力。Xie等基于HPLC-UV代谢组学研究方法,发现六味地黄丸对角叉菜胶所致大鼠关节炎模型的代谢组学改变具有显著调节作用。贾伟课题组针对左金丸的抗癌作用及人参皂苷对应激模型的干预作用进行了整体药效作用的代谢组学评价。本课题组在高脂食物诱导SD大鼠形成的高脂模型研究中,我们发现高脂食物诱导后大鼠出现明显的代谢组学变化,给药后2周即出现明显差异,而临床常用的指标,如总胆固醇和甘油三酯直到第三周才出现明显变化,说明代谢组学后可以更灵敏地反映高脂食物对大鼠体内代谢组学影响。高脂食物诱导后4、5周逐步稳定,停止给予高脂食物后大鼠的呈现恢复趋势。利用这个模型,我们研究了银杏预防给药和治疗给药对代谢组学的影响,发现高脂饲料喂食后给予银杏治疗能明显调整模型大鼠体内代谢组逆向恢复,而银杏提取物预防组,能够显著延缓高脂引起的内源性代谢组紊乱进程,说明银杏提取物能有效预防大鼠体内的代谢紊乱(图2)。本课题组在金黄地鼠动脉粥样硬化模型中进一步验证了银杏提取物对高脂血症所致代谢组改变的干预作用,从代谢组的动态移行轨迹中可以看出,银杏提取物干预组的代谢组改变速度明显减缓(图3)。相关生物标记物包括脂肪酸、甾醇和氨基酸,如甘油酸、亚油酸(Linoleicacid)、十八碳烯酸(OctadecenoicAcid)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid)、脱氧胆酸(Deoxycholicacid)、赖氨酸(Lysine)、酪氨酸Tyrosine等。因为这些内源性化合物与体内的脂代谢等密切相关,因此提示银杏总提取物通过调节脂代谢发挥其药理效果。但整体来说,中药整体药效作用与作用机制的代谢组学研究尚处于起步阶段,相关研究报道均缺乏与相应化学药物的对照研究,现有研究结果只能说明中药针对特定病症模型是否有效(即基于是否能调节和恢复失衡的代谢组进行判断),而对于中药的整体药效作用特点及与相应化学药物比较的作用优势尚未能得以体现,多靶点作用机制研究还基本没有涉及。本课题组基于自发性高血压大鼠模型,针对人参总皂苷的调节血压作用及对抗高血压所致心血管病变的整体药效作用与潜在作用机制进行了代谢组学与经典药效学的结合性研究。自发性高血压大鼠(SHR,spontaneouselyhypertensiverats)是公认的高血压模型动物,广泛用于高血压实验研究,在正常条件下生长可以自发性地出现稳定的高血压。实验研究证实,从10周龄开始SHR大鼠的血压已显著高于同周龄正常WKY对照,随着高血压的发展SHR大鼠出现人类原发性高血压类似的一系列亚细胞形态和结构改变和高血压后期病理改变,如左心室肥厚、心肌现肥大、心肌纤维增多、增粗、排列紊乱、细胞核增大,肌浆网增生及扩张、心肌间质内小灶状炎细胞浸润;部分肾脏切片可见部分近曲小管上皮细胞变性、坏死、脱落,管腔不完整。SHR组血浆中血管紧张素II(AngII)、醛固酮(ALD)水平均显著高于对照;心肌AngII水平和肾组织ALD水平明显升高。从代谢组学表现看来,SHR大鼠代谢表型与WKY明显不同,随着鼠龄的增加,SHR与WKY大鼠的代谢表型呈现明显的与高血压疾病和大鼠鼠龄相关的动态变化(图4)。研究还发现多个与高血压疾病有关的生物标志物(biomarkers),如:硬脂酸,棕榈酸,吲哚丙酸,α-生育酚,蛋氨酸,精氨酸,丝氨酸,胆固醇等,这些化合物不仅是疾病发生发展的内在表现,也可能是整体评价药效的关键。说明代谢组学能从整体和单个化合物两个方面动态地反映疾病发展引起的内源性物质变化,这为代谢组学应用于药效学评价奠定了基础。在研究不同剂量人参总皂苷(高剂量30mg·kg-1,低剂量3mg·kg-1)对高血压大鼠的影响时,还发现人参总皂苷对SHR大鼠整体药效作用还呈现了明显的剂量依赖性。高剂量人参总皂苷对SHR大鼠有较缓和的降压作用,低剂量作用稍弱,但组间未见显著差异。用药4周对体内代谢组学影响不明显。持续给予人参总皂苷8周后,在缓和降低血压的同时,SHR大鼠的代谢组出现较明显的变化,表现在给药组与模型对照组分析图上出现明显差异,给药组特别是高剂量组的样品向正常组趋近,体现高剂量人参总皂苷较为明显的代谢组学纠偏作用。同时,人参总皂苷高、低剂量组在PCA图上能够相互区分开来,其中人参总皂苷高剂量治疗后SHR体内代谢组明显更趋近于正常水平,而人参总皂苷低剂量组的调节作用显得较弱。为了进一步探索用代谢组学方法进行中药整体药效作用评价,体现中药的整体作用优势和特点,揭示其潜在作用机制,我们还比较研究了人参总皂苷和四种经典的化学降压药物卡托普利、氨氯地平、特拉唑嗪、氢氯噻嗪的降血压作用、对组织器官的保护作用和体内代谢组的影响。研究结果表明人参总皂苷从第三周起逐渐表现出缓和的降压作用。氨氯地平、卡托普利和特拉唑嗪能显著降低SHR大鼠的血压,其降压幅度明显强于人参总皂苷。与化学药更迅速的降压作用相比,人参总皂苷降血压作用平缓、停药后血压上升缓慢,呈现持久的后续降血压效果。从血管紧张素II、醛固酮、左心室肥厚指数、组织切片检查结果看,人参总皂苷高剂量组、卡托普利、氨氯地平能起到一定保护心脏、肾脏的作用。说明其在降低血压的同时也能缓解高血压引起的并发症和较好对的药效学作用。对人参总皂苷和四种化学药调节SHR大鼠内源性小分子化合物的数据进行分析后,发现人参皂苷治疗后自发性高血压大鼠内源性小分子化合物明显接近正常组,而从总体上看西药组远离正常组,即西药对整体代谢组学的调节作用较弱,特别是氢氯噻嗪和特拉唑嗪。虽然发现氨氯地平、卡托普利具有一定程度的调节作用,但与人参皂苷给药组相比这两组更偏向高血压对照组,说明其对内源性小分子的调节作用仍然比人参皂苷较弱。从这些结果可以看出血压指标与代谢组学指标之间存在不一致的现象。我们认为血压是个体所表现出来外在指标,而代谢组学所测定的对象是内源性物质,反映了机体内在指标,是疾病内在本质问题的直接表现,因此可能更准确地反映了疾病的本质状态。将代谢组学应用于药效学评价,用整体内源性物质或生物标志物群作为指标,从内源性化合物的浓度水平变化角度考察药效学,尝试建立以整体、内在指标作为目标的药效学评价方法可以弥补原有外在指标的不足。通过人参总皂苷对抗自发性高血压大鼠整体药效作用的代谢组学研究工作,我们认为构建以传统的生理生化、病理生理研究为基础、以代谢组学的整体代谢谱和生物标志物为新指标的综合药效评价体系,结合中药与化学药物的对比分析,对于最终建立符合中药特点的新型药效评价体系具有示范性作用和重要科学意义。4价格补充4.1关于中药整体效作关系的初步筛选当前,代谢组学的主要研究手段是通过NMR、LC-MS、GC-MS等定量分析技术获得尽可能多的内源性代谢物含量信息后,采用主成分分析等模式识别技术对成千上百个代谢物信息进行降维处理,通过Scoringplot方法进行组间样本的判别区分,通过Loadingplot方法获得相关生物标记物群的信息。在进行中药整体药效作用评价时,目前还只能通过正常组、模型组与给药组样本在Scoringplot二维(2个主成分)或三维空间(3个主成分)的分布位置关系进行直观分析,例如当给药组在空间位置上趋于正常组时,可以得出“有效”的结论,而当给药组与模型组在Scoringplot中重叠时可以得出“无效”的结论。但如何根据代谢组学的研究结果,定量表征中药的整体药效作用强度,目前尚缺乏相应的化学信息学处理方法。显然,单纯根据Scoringplot的直观分析以判定中药方剂的整体药效作用是远远不够的,加强代谢组学研究中的数据挖掘与信息处理方法研究,对于最终基于代谢组学技术,建立客观、量化的中药整体药效作用评价体系具有重要意义。4.2网络研究的技术对策中药方剂的药效学研究不能仅停留在对整体药效作用的评价上,只有深入阐明中药方剂多组分、多途径、多靶点的协同整合作用机制,才能科学、有效地针对经典方剂进行现代化改造与深层次开发。代谢组学研究技术的引入为中药方剂整体药效作用的评价提供了强有力的手段,然而中药多组分、多靶点复杂作用机制网络研究尚存在很大的技术和研究思路挑战。尽管对于代谢物的代谢网络、途径已有了较深入的理解和认识,但是对于代谢物与基因、蛋白功能以及整体生物学功能状态之间联系的认识还相当局限,而这正是阻碍基于代谢组学研究结果诠释中药方剂多靶点作用机制的主要原因。本课题组在针对人参总皂苷对自发性高血压大鼠干预作用的研究中,采用与多个靶点明确化学药物的代谢组学比较研究的方法,通过不同靶点干预后相应的生物标记物群谱的比较分析,获得了人参总皂苷多靶点作用机制的初步信息。因而,应用各种手段包括靶点明确药物的干预、siRNA干扰、基因敲除等方法,通过代谢组学研究,获得对特定靶点功能的“生化表型”认识,无疑将有助于通过代谢组学研究手段获得对中药多靶点作用机制的认识。值得期待的是,综合应用基因组、蛋白质组、代谢组学等研究技术手段,并通过化学/生物信息学方法,沟通基因-蛋白-代谢物之间的复杂网络关系,将可能成为打开中药方剂多靶点作用机制这一“黑箱”的“金钥匙”。4.3研究人员之间的融合和交融药代动力学是研究外源性药物究在生物体内外的吸收、分布、代谢与排泄动力学过程与机制的一门学科,而代谢组学则是以生物体内源性小分子代谢物组为研究对象、揭示生物体整体功能状态及对外界刺激应答反应的一门组学学科,因而我们可以把代谢组学理解成为药效学研究的一种新型技术手段。尽管二者的研究对象不同,但相互之间存在可融合和相通之处。例如,已有学者尝试运用代谢组学的研究技术思想进行药物复杂代谢产物的检出与鉴定,对于中药复杂组分的体内代谢研究而言,代谢组学的研究技术方法与思想将无疑具有很大的借鉴价值和意义。我们在2006年度申请的国家自然科学基金重点项目(中药复杂药效物质的确证及整体药代动力学研究新思路与方法,No.30630076)中明确提出通过药物代谢动力学与代谢组学的整合研究,建立符合中药方剂多组分、多靶点作用特征的PK/PD结合研究技术方法,旨在融合二者在分析技术方法上的相通性及研究对象上的互补性,同步揭示中药方剂复杂体内药效物质基础与整体药效作用,并试图通过有效成分体内动力学过程与相关生物标记物群的整体量变关系,揭示各成分的药效作用特点与其对整体药效作用的贡献度。目前本课题组正围绕相关研究思路,开展探索性的研究,以期能为中药整体PK/PD结合研究提供可行的研究思路与技术方法。4.4中医证动物模型的代表性研究代谢组学的引入与发展,为中药整体药效评价研究提供了全新的技术手段,使得从细胞、组织器官及整体水平评价中药多组分、多靶点协同整合药效作用成为可能,这对于应用现代科学手段体现中药方剂在多基因复杂病变中的疗效优势具有重要意义。但对于中药方剂多组分、多靶点作用机制研究而言,单纯应用代谢组学研究技术还难以提供丰富、有价值的信息,包含代谢组学技术在内的系