代谢组学研究中数据处理方法的探讨

代谢组学研究中数据处理方法的探讨

代谢组是通过代谢分析的一般方法研究功能蛋白如何产生能量并处理体内物质的结果。代谢物质直接反映了生物化学中的功能。换句话说，代谢组是评价细胞和水体内源性和外源性代谢浓度与功能关系的学科。代谢物组学的出现,特别在药物安全性研究中的应用,认为该新兴的学科分支会对药物安全性研究产生革命性的影响。它与药物的药效和毒性筛选和评价研究、作用机制研究和合理治疗用药密切相关。代谢物组是反应机体状况的分子集合,所有对机体健康影响的因素均可反映在代谢物组中,基因、环境、营养、药物(外源物)和时间(年龄)最终通过代谢物组对表达施加影响。代谢物组是评价健康和治疗的合适的分子集合。因此研究代谢物组学对药物治疗有直接意义。代谢组学是定量分析生物系统对机体反应或基因改变所产生的动态的、多参数应答的一项新发展的技术。它可有效地应用于生物系统的机制研究及生物系统的生产优化研究中,代谢组学与代谢工程方法的联合在生物工程中的应用已显示出巨大的潜力。代谢组学通常以核磁共振光谱(NMR)或液质联用(HPLC/MZ或GC/MZ)为测量手段,获得的数据(核磁共振图谱、色谱图或质谱图)具有多元性和复杂性,很难直接分析,需要采用模式识别(PR)的方法进行聚类分析和生物标志物(biomarker)的识别。在代谢组学数据处理中,主成分分析法(PCA)是一种最常用的无导师模式识别方法,但在用PCA进行数据分析时通常存在以下问题。(1)代谢组学数据分析普遍采用的经典PCA方法对离群样本点比较敏感,离群样本点的存在会严重影响聚类结果和生物标志物的寻找结果,然而在代谢组学获得的数据中,由于实验的操作因素或样本本身的原因,经常会有离群样本点存在的现象。(2)一些代谢组分在正常的生理条件下或不同的个体之间有较大的差异,这些非保守性的代谢组分会造成同一类样本在PCA的得分图上距离较远,并且使不同类之间有相互的交叉,难以达到正确的分类,而且这些组分很有可能作为假阳性的生物标志物出现在PCA分析投影图中,使真正的生物标志物在投影图中不易被找出。(3)代谢组学的目的是研究机体所有的代谢物,而不同代谢物可能有较明显的尺度差异,若获得的数据不消除尺度差异直接用PCA的方法进行分析,主成分的选择会受到浓度较大组分的影响,因此聚类分析结果和生物标志物的寻找结果主要是浓度较大的组分决定的,一些浓度小的代谢组分的影响通常体现不出来,而这些小浓度组分往往有很重要的生物学意义。以上所述问题目前在代谢组学相关的文献中已经提出了一些解决办法。(1)在离群样本点诊断方面,Holmes等提出离群样本点诊断图的方法;在用经典PCA分析中,可以在得分图上画出一定置信度的置信椭球,处在置信椭球外的样品点被认为是不适合利用PCA分析,提示它们可能为离群样本点;对HCA的聚类分析方法得到的树形图观察,也是一种提示哪些样品点为可能的离群样本点的较直观且简便的方法。(2)在非保守性代谢组分的存在会对分析结果产生影响方面,在分类情况已知的情况下,可以用有导师的方法进行研究,利用已知的分类情况进行特征代谢物的提取,以用特征代谢物为指标能达到预期的分类效果为标准,确定哪些是特征代谢物,从而排除了非保守性代谢组分;另有文献提出,对已知分类情况的每一类作PCA分析,若在得分图上同一类样品分布较为分散,则证明有非保守性的代谢组分存在,在投影图上,对主成分贡献较大的组分即为非保守性代谢组分,即使这些组分在对所有的样本进行PCA分析时在投影图上对主成分的贡献也较大,则也不能将他们算作是生物标志物。(3)在解决不同代谢组分之间存在尺度差异方面,可以用尺度同一化的方法包括mean-scale,auto-scale,log等消除不同代谢物尺度差异的影响,使数据的尺度相同,然后再对处理后的数据进行分析。本文探讨了一些新的方法以求解决上述问题。本文数据处理所采用的原始数据是向发表在Bioin￣formaticsVol.18Suppl22002杂志上的Applicationofmetabolomicstoplantgenotypediscriminationusingstatisticsandmachinelearning的作者索取。文中的实验背景是研究Arabidopsisthaliana属植株的基因型为Co10的8个母本植株、基因型为C24的8个母本植株及它们的杂交子代Co10*C24的8个植株、C24*Co10的8个植株的代谢组学,拟通过代谢组学的研究找到这些基因型不同的植株在代谢物方面的主要差异,并找到可以区分不同基因型植株的代谢物水平上的生物标志物。文中的数据处理中直接用PCA方法对原始数据进行聚类分析和生物标志物的寻找分析,结果得分图显示的聚类情况不是很理想,类别之间有明显的交叉,投影图中有许多组分都有较大的贡献,并且找到的生物标志物都为浓度相对较大的代谢组分。基于这种情况,作者为了验证离群样本点的诊断、非保守性代谢组分的排除以及数据的比例化处理对结果的改进作用,采用上述文献中所使用的原始数据,进行了如下的尝试性分析。在离群样本点诊断方面将稳健PCA算法(ROBPCA)中离群样本点的诊断方法用于代谢组学数据离群样本点的诊断,预示了一些潜在的离群样本点的存在,证明了这种方法的可行性;在非保守性代谢组分方面将类内差异大于类间差异作为衡量非保守性代谢组分的标准,并将判断为非保守性代谢组分的代谢物排除后再进行数据分析,结果聚类分析的结果和生物标志物的寻找结果得到明显的改善;在解决不同代谢物尺度差异方面,用mean-scale的方法对数据进行数据尺度同一化处理后用PCA的方法进行分析,聚类的结果较为理想,并且找到了一些浓度较小的组分在4类样品间有较明显的差异,可能是有生物学意义的生物标志物,这与直接对原始数据进行分析找到的浓度较大的生物标志物有一定的互补性,预示了对原数据和尺度同一化后的数据同时进行分析的重要性。1远离集体检测点的诊断1.1稳健pca算法主成分分析法(PCA)是对多元数据进行降维的一种主要方法,它处理的目的是有效消除多信息共存中的重叠部分,提取出主要成分。经典的主成分分析法(classicalprinciplecomponentanalysis)经常被用于代谢组学数据分析中。算法是根据原数据协方差矩阵的结构,寻找新的原变量线性组合后得到的主成分,使沿着主成分的方向,原数据的方差最大。代谢组学数据的聚类分析通常在PCA分析得到的得分图(scoreplot)中进行,生物标志物的寻找通常根据PCA分析得到的投影图(loadingplot)中各变量对主成分贡献的大小来判断。然而经典PCA对数据中的离群样本点(outlier)较为敏感,若数据中有离群样本点存在,则前几个主成分会被明显地拉向离群样本点,从而不能反应正常的数据点间的差异。因此当数据中有离群样本点存在时,用经典PCA进行数据降维分析得到的结果是不可信的。稳健PCA算法的目的是找到不受离群样本点影响的主成分,从而对离群样本点存在的数据进行分析时,也能得到准确的结果。稳健PCA的算法有寻踪投影法(projectionpursuit)和最小协方差决定法(minimumcovariancedeterminant)。目前ROBPCA是一种新发展起来的结合以上两种算法的稳健PCA算法,在进行主成分分析的同时,还可以作出离群样本点诊断图(outlierdiagnosticplot)。图中的横坐标代表样本距样本中心的马氏距离,纵坐标代表样本未能被PCA解释的残差,处于右上角区域的样本为强离群样本点,处于左上角和右下角区域的样本点为弱离群样本点。这种诊断图若应用于代谢组学的数据分析中,可以从生物信息学的角度提示哪些样本为潜在的离群样本点,以便进行更深入地分析和判断;若诊断的结果经分析得到验证,排除离群样本点后对数据进行分析会更好地反映数据中蕴含的生物学意义。1.2第二,离群样本点的认定尝试用ROBPCA的算法进行离群样本点的诊断,所得的结果如图1所示,由图中可以看出Co10基因型的8个植株中有1个强离群样本点,为2号样品;C24基因型的8个植株中不存在较强的离群样本点,但存在2个弱离群样本点,为该基因型样品的1号和2号,对应原数据矩阵的9号和10号样本;Co10*C24的杂交子代的8个植株中1号为强离群样本点,对应于原数据矩阵的17号样本;C24*Co10的杂交子代的8个植株中没有强离群样本点,1号和2号为弱离群样本点,对应于原数据矩阵的25和26号样本。经过上述的方法判断,将一些样本点判断为可能的离群样本点。但以上的方法为统计学的方法,判断的准确程度有一定的概率问题,尤其是在小样本量数据的情况下误判的概率会更大;而且某种情况下离群样本点中可能会蕴含着更重要的生物学意义。因此需要对这些可能的离群样本点作进一步深入的考察。首先对数据来源的图谱(质谱图或核磁图)进行观察,与其他的图谱进行对照,观察是否有异常的谱峰存在,若证实在测量中存在问题,根据实际情况补实验点或直接将已确定为离群样本点的实验点排除再进行分析;若排除是测量仪器造成的误差,则可能是生物体本身存在的原因或有新的有意义的生物学现象出现,使代谢组的情况发生明显的变化,这时要在所取得的实验点作重复试验,并在该实验点附近的实验条件下补数据,再进一步深入地研究。2聚类结果和pca分析本文将类内差异大于类间差异的组分定义为非保守性代谢组分。组分的类内差异用标准差来衡量,组分的类间差异用每组数据的均值的标准差衡量。寻找非保守性代谢组分是用matlab软件编程进行的。从原始的数据矩阵中排除找到的非保守性代谢组分再用PCA进行分析,与原始数据直接PCA分析作比较,所得到的结果如下。由图2的聚类结果可以看出排除非保守性代谢组分后,聚类结果可以达到明显的改善,前两个主成分PC1和PC2上可将两个母本Col0与C24分开,并且可将两个母本与子代Col0*C24和C24*Col0分开;第三主成分PC3上可将两个子代基本分离,虽然没有达到完全的分离,但已经比原有的不经排除非保守性代谢组分直接用PCA分析得到了明显的改善(图3),并且分离的正确率与原文献用前馈型神经网络所得的结果一致。在PCA分析得到的得分图上能达到正确的分类的基础上,生物标志物的识别变得更容易,并且避免了假阳性生物标志物的出现。在排除非保守性代谢组分后,由图4可以看出,23,38,61,65,66,199号组分对PC1,PC2,PC3构成了大部分的贡献,选出它们做生物标志物进一步分析可以有效地解释4类样品之间的差异;而在未排除非保守性代谢组分之前,由图5可以看出,许多组分在PC1,PC2,PC3都有较大的贡献,因此很难找出几个作为有效的生物标志物来解释4类的差异。3主成分pc3分离作者对排除非保守性代谢组分的数据经过mean-scale方法预处理后,再用PCA方法进行分析,所得的结果如图6,图7。由score图(图6)可以看出在第一主成分PC1上可将1,2类与3,4类分开;在第二主成分PC2上可将1和2类分开;在第三主成分PC3上可在一定程度上将3和4类分开,而且分离的效果比不经过预处理的结果(图2)要明显。由loading图(图7)看出,虽然不能像在原始数据排除非保守性代谢组分不经过任何预处理进行PCA分析得到的loading图那样,可以由几个组分对PC1,PC2,PC3构成大部分贡献,但是129,214,389,420号组分都在PC1,PC3上有相对比较大的贡献,139号组分在PC2上有相对比较大的贡献,而且这些组分都是浓度较小的组分,说明经过scale方法找到的biomarker多是浓度较小的组分,这些组分也不能忽略,应仔细分析其浓度在组与组之间变化的特点,判断这些小浓度组分是否为噪音,以确定它们是否为有意义的生物标志物。4非保守性代谢组分的识别稳健PCA算法(ROBPCA)适合于代谢组学数据分析中离群样本点的诊断。诊断结果从生物信息学的角度预示的潜在的离群样本点有待于进