代谢组学研究进展

代谢组学研究进展

1在生物标记物中的应用代谢组学是一种新的基础研究概念、遗传因素组学和蛋白质组学。在对特定基因或环境条件进行评估和干预后，考虑到生物因素的变化，它是研究生物体所有代谢方法的新技术。其研究对象主要是相对分子质量1000以下的内源性小分子。与其他组学相比,它更能真实反映机体系统的生理和病理状态,为正在进行的生物过程提供一种瞬时的、综合的快照。在英文文献中,Metabonomics和Metabolomics均指代谢组学,前者一般以生物体液和组织为研究对象,Nicholson将其定义为定量分析生物体因病理生理刺激或基因改变引起的代谢应答变化;后者则侧重以细胞为研究对象,Fiehn将其定义为定性、定量分析单个细胞或单一类型细胞株的代谢调控和代谢流中所有低分子量的代谢产物。在Metabolomics研究中,根据研究对象和目的不同,Fiehn首次将代谢组学划分为靶向分析、代谢轮廓分析、代谢组学分析和代谢指纹分析四个层次。在其研究基础上,Kell等提出了代谢足迹分析,即细胞外代谢物分析,进一步扩大了代谢组学的研究范围;随后,Villas-Boas等又将代谢组学划分为靶向分析和代谢轮廓分析两类,后者包括代谢指纹分析和足迹分析。恶性肿瘤是一种多因素参与造成机体各系统功能平衡紊乱的复杂疾病,导致机体病理生理过程变化,最终引起代谢组的改变。研究表明癌细胞具有一种独特的、有别于正常细胞的代谢表型,利用代谢组学技术在给定的时间和条件下可监测正常细胞及癌细胞代谢过程中所有小分子代谢物的波动情况,将有利于预测肿瘤的进展、了解体内物质代谢途径、探索癌症发病机制及药物作用机制等,再结合多种化学模式识别方法,从而发现与特定肿瘤相关的生物标记物。此外以人癌细胞为研究对象还可避免物种差异引起的误差、降低实验成本、减少实验时间,有望实现通过其特征性生物标记物进行癌症的早期诊断。本文对代谢组学研究中的细胞样品前处理方法及细胞层面的代谢组学研究进展做相应的论述。2样品前处理的必要性代谢组学主要是对特定条件下或某一时刻细胞内代谢物进行的分析,因细胞内酶系活跃、代谢转换迅速,取样和样品制备方法显著影响分析结果的准确性、重复性。因此,做好样品的前处理是取得可靠分析结果的先决条件。根据研究对象、目的和分析技术的不同,对样品的前处理要求也不一致,不存在一种普适性的方法,样品处理方法大致分为两步:细胞淬灭和代谢物提取。2.1细胞内开代剂的应用淬灭也称为“灭活”,目的是让细胞内的酶失活,保证代谢物的轮廓“冻结”。对于胞内代谢物,由于采样或脱离培养环境后细胞内代谢状态的变化,造成代谢物种类及含量也随之发生变化,为了正确反映培养环境中细胞代谢物的真实信息,需要立即淬灭细胞,终止胞内反应。理想的淬灭技术应在保持细胞完整性的基础上确保酶迅速失活。淬灭方法包括液氮冷冻法、酸碱灭活法、快速过滤法、低温离心法、细胞刮法、冷甲醇法等。Dettmer等采用低温离心法及细胞刮法淬灭多种贴壁哺乳细胞,结果发现低温离心可引起细胞内大量代谢物的泄漏,不适于代谢组学研究,而细胞刮法较为理想;Lorenz等建立了快速、简便的液氮冷冻法,在INS-1细胞代谢谱的研究中取得了理想效果。Teng等通过17α-炔雌醇引起的乳腺癌细胞代谢谱变化对甲醇淬灭法进行了评价,结果表明该法快速、简便,比传统淬灭法的提取率高50倍。Sellick等以悬浮培养的中国仓鼠细胞为对象,考察了60%冷甲醇(-40℃)、60%甲醇-70mmol·L-1羟乙基哌嗪乙硫磺酸(pH7.4)、60%甲醇-0.85%碳酸氢铵(pH7.4)、60%甲醇-0.85%NaCl的淬灭效果,并采用多种分析方法测定了培养液、细胞提取液及清洗液中的多种组分来考察代谢物泄漏程度,结果表明60%甲醇-0.85%碳酸氢铵淬灭法泄漏程度最小。自1974年Weibel报道了一种能够在短时间内完成取样、淬灭和胞内代谢物提取的快速取样技术以来,该法在悬浮培养的哺乳动物细胞中也得到了迅速发展,并已成功应用于代谢组学研究中。Volmer等以悬浮细胞为研究对象,对多种采样方法进行了评价,结果表明快速过滤法处理效果较佳,具有快速、高效、重现性好、无偏向性等优点,并可直接应用于大量生物样品的分析。研究发现,淬灭过程会导致泄漏即细胞内代谢物的丢失,且泄漏的程度与淬灭时间、温度及加入的淬灭试剂量等有关;随着淬灭剂的加入、淬灭时间减少、离心速度加快,泄漏程度会减轻。既然代谢物泄漏在所难免,在进行样品前处理时应尽量将泄漏的影响降到最低,并注意平行操作,快速淬灭后,迅速低温离心收集样品。另外,由于受细胞种类或分析技术的影响,不同淬灭方法效果可能存在差异,在实际应用中应做全面考察,选择最佳淬灭方法。2.2金融抑制因子及代谢中的金属酶一旦代谢反应通过灭活被停止,代谢产物就需要从细胞中提取出来。根据细胞代谢组学研究层次不同,提取方法及要求也不同。如在靶标分析中,需要采用特定的方法有选择性地提取出相应的组分;而在轮廓分析中,则需尽可能提取出多种代谢物。目前许多研究者以细胞能量代谢中间产物的量为指标,对多种提取方法进行了系统考察,但因各细胞株种类、培养条件、培养基组成及细胞生理条件等不同,造成代谢物水平差异较大,至今仍没有统一的标准方法,实际中应根据化合物及实验目的的不同选择相应的提取方法。一般提取时应遵循以下原则:(1)以适当的回收率从细胞中提取最大量的代谢产物;(2)代谢物不应该遭遇任何理化修饰,将降解控制在最小范围内;(3)防止代谢物泄漏;(4)具有非破坏性。目前,在细胞代谢组学分析领域提取步骤中,传统的液-液萃取法应用最广。文献报道的萃取剂主要有冷甲醇、热乙醇、高氯酸或碱、热甲醇、甲醇-氯仿-水、乙腈等。其中,酸、碱提取法是传统的代谢物提取方法,通常用于提取对酸或碱稳定的代谢物;高氯酸、三氯乙酸已广泛用于细胞内极性代谢物(如核苷酸类、磷酸糖类、有机酸、氨基酸等)的提取,但较低pH会使某些代谢物稳定性降低,如丙酮酸盐、NAD、NADH等;在核苷酸提取物中研究者通常以氯仿萃取,除去脂溶性成分,以减少在色谱柱中的保留,提高重现性。但酸碱提取法需要中和步骤,代谢物的稀释引起回收率的降低;另外因代谢物在沉淀上的吸附可能会影响定量。对于非极性代谢物的提取,如脂类,通常采用有机溶剂法,包括氯仿、氯仿-甲醇-水、乙酸乙酯法等,实验中无盐加入、提取剂易去除,但采用热甲醇等提取时,会引起热不稳定代谢物的降解。到目前为止,以甲醇为代表的有机溶剂提取法在代谢组学分析中的应用最广,具有操作简便快速、无离子抑制效应、pH影响最小、提取物易蒸发浓缩等优点。Dettmer等研究了提取方法对结肠癌细胞株代谢谱的影响,对甲醇、甲醇-水、乙腈、乙腈-水、甲醇-氯仿-水、甲醇-异丙醇-水、酸性甲醇7种提取方法提取的代谢物进行对比分析,结果发现80%甲醇提取出的代谢物最多。在代谢轮廓及指纹分析中,通常采用多相提取剂,以实现对水溶性、脂溶性成分的高通量分析。此外,有研究者采用淬灭-萃取一步法,即将淬灭剂(也称萃取剂)直接加入培养瓶中破碎细胞,同时提取代谢物。Teng等以冷甲醇(-20℃)淬灭-提取出人乳腺癌细胞中的代谢物。Bennett等以人纤维母细胞为研究对象,将80%冷甲醇直接加入弃去培养基的培养瓶中,取得较好的提取效果。Sellick等采用60%甲醇-0.85%碳酸氢铵缓冲液(pH7.4,-40℃)淬灭中国仓鼠细胞,考察了甲醇及其水溶液、热乙醇(90℃)、高氯酸及甲醇-氯仿对细胞代谢物的提取效果,以GC-MS法鉴定出的代谢物数目为指标,结果表明采用甲醇、水依次进行萃取效果最佳,共鉴定出89种代谢物。Hofmann等先以热空气(150℃×5s)处理HepG-2人肝癌细胞,再加入沸水1.5mL,淬灭及提取同步进行。不仅缩短了淬灭时间,还减少了代谢物的泄漏;但不能对细胞进行计数,实验中需采用特定参数进行数据标准化,研究中不常用。而在代谢足迹分析中,一般向培养液中加入蛋白沉淀剂(如三氯乙酸、乙腈等),离心后直接进样或中和后进行分析。除了上述提到的液-液萃取之外,超临界流体萃取、固相萃取、固相微萃取、微波辅助萃取等方法以提取效率高、溶剂消耗低、易于实现自动化等优势在代谢物提取领域也有广泛的应用前景。3核苷酸及糖代谢代谢靶向分析是针对某个或某几个特定组分的定量分析。因其焦点为特定化合物的分析,通常忽略其他大量的代谢组信息,故需要采用具有选择性的样品制备技术除去干扰物,或选择一定的数据预处理技术去除干扰物色谱峰,优化数据质量,提高方法灵敏度和代谢物浓度测定的准确性。但当目标物处于重叠色谱峰中时,需借助专门的化学计量学技术进行解析,如平行因子分析法、多元曲线分辨-交互最小二乘法(MCR-ALS)等。目前,该研究主要集中于与癌细胞能量代谢相关的化合物研究,如核苷类、氨基酸类、脂类、糖类等。肿瘤的发生发展伴随着基因的变化,而核苷酸为RNA及DNA生物合成的前体物质,同时也参与了体内大多数生化反应(如脂肪酸、糖代谢等),在癌症变化过程中其代谢过程及含量也必然会受到一定的影响。研究发现,肿瘤患者与正常人相比,机体内核苷酸类代谢物含量发生了显著改变。Huang等采用HPLC法测定正常细胞及8种癌细胞中的核苷酸,发现不同细胞之间的三磷酸核苷及脱氧三磷酸核苷含量不同;Jia等建立了人肝癌细胞HepG-2中核苷酸类物质的分析方法,并对其代谢物变化进行了初步研究;Lehtimaki等研究发现在神经胶质瘤细胞凋亡过程中核苷酸水平增高,Williams和Anthony等发现CDP-胆碱在其凋亡期间水平也增高;Wang等研究小组以多孔石墨碳为固定相、LC-MS法对HepG-2细胞中一磷酸腺苷进行定量分析,该研究对了解化疗后癌细胞死亡过程中的能量状态奠定了基础。氨基酸及生物胺类组分也在生物系统中扮演着多种作用,如组成蛋白质的结构单元、生物信息传递、细胞增殖、能量代谢等,是各种肿瘤的重要标记物。研究表明精氨酸、牛磺酸、苏氨酸、γ-氨基丁酸、缬氨酸、甘氨酸等为癌细胞特有的标记物。陆伟等研究发现苏氨酸、牛磺酸为肝癌细胞增殖所必需;Kao等采用毛细管电泳法分析了乳腺癌细胞中9种氨基酸,正常乳腺上皮细胞中10种氨基酸,结果在癌细胞中牛磺酸含量升高、谷氨酰胺及谷氨酸等减少,该研究在应用不平衡氨基酸治疗癌症方面可能具有重要意义。Ippolito等在利用MRS研究前列腺神经内分泌癌衍生的前列腺神经内分泌癌细胞中,发现了与能量代谢密切相关的小分子代谢物γ-氨基丁酸及丙二醇,二者在癌细胞中的含量明显增高,与细胞能量利用、细胞增殖及细胞之间信息传递等密切相关。研究发现在各类恶性肿瘤、炎症时脂类代谢物浓度和定位都会发生变化。目前已发现多种与肿瘤相关的脂类标记物,例如胆碱、磷酸胆碱、磷酸卵磷脂、胆固醇等变化谱是细胞膜破坏的标志,这些变化表明细胞正在经受各种因素刺激而导致凋亡的过程。目前在各种类型癌症中已发现其水平的变化,如脑肿瘤、肉瘤、肝癌、前列腺癌等。此外在细胞凋亡期间,胶质瘤及去分化的多形态脂肪瘤中多不饱和脂肪酸的含量增加。同样,肿瘤对糖的代谢也有影响。1920年,德国生物化学专家Warburg首次报道肿瘤细胞的糖酵解活性较正常细胞明显增强。进一步研究表明,即使在氧气充足条件下,这种现象同样存在,被称为“Warburg效应”。目前已发现多种与糖代谢相关的生物标记物,如丙酮酸、乳酸、异丁酸等。近年来,探索通过靶向糖酵解代谢途径治疗恶性肿瘤的策略正备受关注。4细胞代谢的表征代谢轮廓分析是对预设的一些代谢产物的定量分析,如某一结构、化学性质相似的化合物、预先选择的某些代谢途径的所有中间产物、多条代谢途径中的标志性组分等,是对大范围内的代谢物进行检测,目的是获得一套完整的、综合的代谢组轮廓,以便更直观地理解参与代谢的化合物之间以及所有酶之间的相互作用,是对细胞代谢的抽象表达。目前,采用基于NMR法的代谢轮廓分析已寻找出多种与能量代谢相关的标记物,主要涉及到糖酵解、三羧酸循环、胆碱和脂肪酸代谢等,在癌症诊断和治疗方面扮演着重要角色。此外,国内外许多研究者对各种肿瘤细胞的代谢轮廓与细胞形态学变化之间的相关性进行了研究,但细胞内的代谢组不是静态的,不同个体对外界扰动所作出的响应也存在较大的差异,使得代谢物的准确测定及其与疾病的相关性研究仍面临着巨大挑战。Bullinger和Chen等研究了MDA-MB-435,MCF-7及MCF-10A细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞中心代谢(包括糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸循环、甲羟戊酸途径、脂肪酸和氨基酸的生物合成途径等)中大量的关键性化合物,同时对各种代谢途径的通量进行了评价;结果发现不同的外界扰动及在细胞周期中,各细胞的特定代谢轮廓具有明显差异。从以上两方面的概述可以看出,靶标分析与代谢轮廓之间的差异较小,二者之间的差异主要由所测代谢物的数量和所得数据质量来决定。5细胞代谢特性代谢组学分析是采用高通量的分析技术对限定条件下的特定生物样品中代谢组分的定性和定量,即整体性地分析生物体对内外因素做出动态应答的所有代谢物小分子。生物体在受到外源性干扰后,其所处的内环境也相应的发生改变,原本正常的代谢状态也随之发生变化。在细胞研究的层面上,其研究的是细胞受到外界扰动后胞内所有代谢物的综合表现——全局观点,通常采用现代分析方法、计算机技术及统计方法,以高通量实验和大规模的计算为特点,寻找生物体应激前后代谢差异,进而确定与疾病相关的生物标记物。Bugrim指出根据新近发展的系统生物学的概念,任何预测药物吸收、分布、代谢、排泄以及毒性评价成功的技术都需要关联内源性物质代谢变化来考虑药物的代谢情况,因此通过代谢组学技术不仅可研究药物本身的代谢,还可研究药物及其他外界刺激引起的内源性代谢组的变化,更能直接地反映体内生化过程,阐明药物靶点或作用机制。此外该技术为从分子水平上对细胞种属进行鉴定和评价提供了可能,栗晖等利用UPLC-TOFMS和MarkerLynx技术研究了5种不同来源的细胞内代谢物,采用PCA和PLS法对分析结果进行统计分析并鉴定出10种可能的潜在生物标记物,实现了细胞种属之间的分类。癌细胞具有旺盛的代谢状态,而癌症的发生、发展亦离不开细胞周围的微环境。肿瘤生长所依赖的微环境主要包括葡萄糖、氧分及其他营养性生长因子,并呈现出明显的酸性,而乳酸盐等一些小分子物质是构成这种酸性环境的主要成分,因此乳酸盐含量增加也预示着癌症的发生。目前,国内外许多研究者考察了多种外界扰动(如低氧、营养物质、药物等)对细胞代谢的动态变化、细胞生长状态及代谢关键酶活性等的影响。分别介绍如下。低氧环境在恶性肿瘤,尤其是一些实体瘤中很常见,当肿瘤体积达到一定大小时,氧气便很难透过。在该情况下,即便线粒体功能正常,细胞的有氧呼吸也会因缺氧而被抑制,而癌细胞在增殖过程中却能很好的适应这种状态,其主要是基于癌细胞在缺氧或低氧状态下的糖酵解能力增强,把葡萄糖作为能量的源泉。通过研究缺氧条件下细胞代谢通路及特定标记物,将有助于探明和发现癌细胞特有的代谢机制。Weljie等采用基于1HNMR的代谢组学法考察了缺氧(1%O2)对体内、外乳腺癌细胞的影响,并比较分析了缺氧和常氧状态下细胞的代谢情况,利用正交-偏最小二乘法判别分析鉴定了缺氧条件下的一系列标记物(如丙酮酸盐、乳酸盐、1-甲基组氨酸等)。施冬云等以人肝癌SMMC-7721细胞和正常肝L02细胞为研究对象,在单纯缺氧条件下观察细胞生长,并检测糖代谢关键酶(如丙酮酸激酶、己糖激酶等)的活性,得出癌细胞较正常细胞具有更强的缺氧耐受性。营养物质对癌细胞代谢的影响在基础研究领域应用较多,如优化和控制细胞培养过程,以避免环境对细胞的不利影响。影响细胞代谢的环境因素很多,如葡萄糖、氨基酸、血清、代谢副产物、pH、细胞密度、渗透压等。体外培养细胞的代谢与在体细胞不同,前者可获得细胞代谢行为与环境之间的关系,深入对细胞代谢网络的了解。如培养液中葡萄糖浓度较低时,细胞能量供应不足,导致细胞生长受阻、代谢通路改变等。Hartmann等以结肠癌SW-480细胞为分析对象,评价了无血清培养基、血清替代品、血清减少培养基对细胞代谢的影响,并利用SPME-GC-MS技术考察了三种培养条件下细胞挥发性代谢组方面的差异,结果发现细胞在各培养基中的形态和挥发性代谢组均有显著性差异。有生物活性的药物作用于生物体后,会对生物体代谢酶的表达、代谢产物组成及其相对浓度等产生显著的影响。目前,许多研究者利用该研究手段考察了多种抗癌剂对细胞生长、代谢等方面的影响,其中以抗代谢类药物为主(如5-FU、吉西他滨、GTI-2040、羟基脲)[43,44,45,46,47,48],此外还有铂类(如顺铂)、烷化剂、抗生素、植物药及海洋天然产物等。一般将癌细胞株置于不同浓度的药物中,或在不同时间内用药物处理细胞,以考察细胞受到药物抑制作用后所产生的代谢物动态变化,为理解化疗中细胞凋亡或增生机制、药物筛选、毒理学机制、药效机制等奠定了基础。Griffin等将子宫内膜癌Ishikawa细胞株暴露于不同浓度的他莫西芬中,应用梯度MAS-NMR技术进行细胞代谢物检测,结果发现随着药物浓度的升高,乙醇胺、葡萄糖、谷氨酸、酪氨酸、腺苷等浓度也随之升高。Cohen等、VanMoorsel等分别以白血病细胞株、21种实体瘤细胞为对象,考察吉西他滨对核苷酸库的影响:前者发现白血病细胞中dNTP库减少,而耐药细胞株中dNTP库无显著性变化,后者发现NTP库与细胞-药物之间的敏感性无关,给药后不同细胞内NTP库变化不尽相同。6代谢足迹分析研究表明,生物体在生长过程中会分泌大量代谢物,特别在不平衡生长条件下,能分泌许多具有生理活性的初级和次级代谢物以及信号分子,这种分泌过程能清晰地反映细胞的代谢活动以及相关基因的转录和翻译水平,即细胞外代谢组学。该分析技术已成功应用于代谢组学研究中,是由英国科学家Kell等在2003年首先设计出的一种用于代谢组学细胞功能分析的新技术,其采用直接注射质谱技术,以细胞培养液为分析对象,监控细胞从生长培养基中消耗营养物以及分泌代谢物质培养基的全部过程。Kell将其定义为细胞外代谢组学,Nielsen和Oliver等引入Endo-Metabolome和Exo-Metabolome术语以区分细胞内、外代谢物。该分析技术可与细胞内代谢组研究相互补充,为进一步完善代谢组学的研究范围打下坚实基础。代谢足迹分析与前述细胞内代谢物的分析不同,具有以下特点:(1)样品制备过程简便,无需淬灭及提取步骤;因细胞内代谢物是动态的,且大多数代谢物的转换速度极快,从几秒钟至几分钟,故需快速淬灭细胞以冻结新陈代谢,再采用一定的方法提取代谢物,上述实验均增加了操作上的困难,很可能造成对代谢通量的误解;(2)胞内某些生化反应与胞外基质相关,如复杂基质的降解反应、细胞信号传导调控等,只能通过细胞外降解产物的测定来评价;(3)便于考察细胞对外界物质的利用情况,优化细胞培养技术。Pansikanti