美拉萨嗪对葡聚糖硫酸钠诱导溃疡性结肠炎模型h1、h17和reg亚群的影响

美拉萨嗪对葡聚糖硫酸钠诱导溃疡性结肠炎模型h1、h17和reg亚群的影响

溃疡性胃炎（iu）是一种常见的炎症性肠病。这是一种病因不明、以胃肠道慢性非特异性炎症为主要原因的疾病。近年来，它已成为一种常见的神经系统疾病，其主要临床表现为腹痛和腹泻。关于其病因目前大多数研究认为与环境、遗传、感染及免疫学因素相关,而免疫学因素被认为与UC的发生发展密切相关,CD4+T细胞亚群在UC发病中尤为重要。本研究通过检测葡聚糖硫酸钠(dextransulfatesodium,DSS)诱导的小鼠UC模型结肠组织及外周血单个核细胞中CD4+T细胞胞内IL-17、IFN-γ和核转录因子Foxp3的表达,观察UC小鼠模型CD4+T细胞亚群的改变,并研究美沙拉嗪(mesalazine,MSLZ)预治疗对各CD4+T细胞亚群的影响,探讨UC可能的发病机制及美沙拉嗪治疗UC的免疫学机制。材料和方法1实验动物与试剂无病原环境出生的C57BL/6小鼠(6~8周龄)(购自广东省实验动物中心)。DSS分子量为35000~40000,购自MP。抗小鼠CD3-PE-Cy7(BioLegend);抗小鼠CD4-FITC、抗小鼠CD272-APC、抗小鼠IL-17-PE、抗小鼠IFN-γPerCP-Cy5.5和抗小鼠Foxp3-PE-Cy5.5均购自eBioscience。流式细胞仪为BD产品。破膜剂为杭州联科生物公司产品。美沙拉嗪为葵花药业产品。大便隐血试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。胶原酶II为Sigma产品。2u3000小鼠参阅文献制作UC模型,取小鼠16只,随机分为对照组(Con组)和实验组(DSS组),每组8只小鼠,2组小鼠性别比、周龄、健康状况及体重均无统计学差异,可进行后续实验。Con组小鼠给予自来水自由饮用,DSS组给予5%DSS(用水溶解)自由饮用,各组小鼠实验时间为7d,第8天处死小鼠。造模后每天观察小鼠活动情况、毛色变化、大便性状、颜色及有无出血等情况。3美拉嗪颗粒的提取取小鼠8只,给予5%DSS造模,在造模的同时给予美沙拉嗪治疗,作为美沙拉嗪治疗组(MSLZ组),每天用美沙拉嗪(缓释颗粒;商品名:艾迪莎)灌胃治疗,按实验动物与人体表面积比等效剂量换算比率,将每天剂量折算成小鼠等效剂量作为中剂量用量[小鼠用量(g/kg)=人每天口服药量(g)×0.0026/0.02kg],时间为7d,同样每天观察小鼠活动情况、毛色变化、大便性状、颜色及有无出血等情况。4外周血单个核细胞pb-mc分离第8天取小鼠内眦静脉血,用EDTA-K2抗凝,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PB-MC),对细胞进行活性检测和计数后重悬于含2%胎牛血清的PBS中,备用。5dtt法小鼠结肠黏膜固有层单个核细胞(laminapropriamononuclearcells,LPMC)的分离参阅文献方法进行。取小鼠肛门至盲肠末端结肠,纵切,去内容物,将组织剪碎足够小,于含EDTA和二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)的PBS液中孵育30min,离心,重复2次。将组织置于酶液(胶原酶II含量为0.5g/L的RPMI-1640)中,37℃水浴消化30min,离心,过滤,收集滤液,回收滤渣重复消化1次,收集所有滤液加入到含有小鼠淋巴细胞分离液的离心管中离心,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离单个核细胞,2%FBS-PBS洗涤,对细胞进行活性检测和计数后重悬于含2%胎牛血清的PBS中,备用。6荧光定量pcr检测cd3-pe、cd3-cy7/cd8-percp-cy5.5和ifn--percp-cy5.5的表达将分离的单个核细胞分成4份,每份细胞数为1×106,加PMA/IonoMixture体外37℃、5%CO2培养箱孵育4h,最后2h加BFA孵育,洗涤,1份加同型对照抗体,其余3份分别加入CD3-PE-Cy7/CD4-FITC混合抗体和CD3-PE-Cy7/CD8-PE混合抗体,避光孵育25min,PBS洗涤,加破膜剂A液100μL避光孵育15min,PBS洗涤,加破膜剂B液100μL,同时分别加入IL-17-PE/IFN-γ-PerCp-Cy5.5混合抗体、Foxp3-PE-Cy5.5和IFN-γ-PerCp-Cy5.5,避光孵育25min,洗涤,固定,上流式细胞仪分析。7植物种bf0级:黏膜固有层无中性粒细胞浸润;Ⅰ级:固有层有少量中性粒细胞浸润(<10cells/HPF),并累及部分隐窝;Ⅱ级:固有层明显中性粒细胞浸润(10~50cells/HPF),累及50%以上隐窝;Ⅲ级:固有层大量中性粒细胞浸润(>50cells/HPF),同时伴有隐窝脓肿;Ⅳ级:固有层明显急性炎症伴有溃疡形成。8统计学处理方法采用SPSS16.0软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示,组间均数比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1小鼠肠道组织he染色结果DSS诱导的模型组小鼠第4天开始体重出现下降,到第7天体重下降超过15%,MSLZ组小鼠体重自第5天开始出现体重下降,体重下降不超过5%,而对照组体重无明显降低;第4天出现血便,对照组小鼠大便隐血均为阴性,MSLZ组小鼠有2只第5天大便隐血试验阳性;DSS组小鼠7d内无死亡,MSLZ灌胃治疗组无死亡情况;肠道组织HE染色显示DSS组结肠陷窝消失、腺体减少,大量炎症细胞浸润,对照组结肠结构无明显异常,MSLZ组陷窝、腺体结构清晰,少量炎症细胞浸润,见图1。各组小鼠病理组织学分级比较:DSS组组织学分级大部分小鼠为Ⅲ级和IV级;MSLZ组0级有5例,Ⅰ级和Ⅱ级分别为2例和1例,无Ⅲ级和Ⅳ级;对照组0级7例,I级1例,见表1。2cd3+t细胞高表达在DSS诱导的小鼠UC模型中,其外周血单个核细胞中CD3+T细胞高表达IL-17、IFN-γ及Foxp3,肠黏膜单个核细胞中CD3+T细胞高表达IFN-γ和Foxp3,但IL-17的表达与对照组无差异,见图2。3小鼠lpmc细胞内细胞因子检测根据不同CD4+T细胞亚群产生细胞因子的不同,我们进一步分析了UC模型小鼠外周血和肠组织中Th1(CD3+CD4+IFN-γ+)、Th17(CD3+CD4+IL-17+)和Treg(CD3+CD4+Foxp3+)细胞亚群的变化,经流式细胞术胞内细胞因子检测结果显示,DSS组小鼠LPMC中Th1、Th17和Treg细胞亚群较对照组均显著升高(均P<0.05);但DSS组小鼠PBMC中只有Treg细胞亚群较对照组升高(P<0.05),见图3。4不同模型小鼠外周血cd4+保肝作用前后外周血cd3+treg细胞荧光强度为了探讨美沙拉嗪治疗UC的免疫学机制,我们进一步检测了美沙拉嗪对UC模型小鼠CD4+T细胞亚群的影响,见图4,我们发现美沙拉嗪预治疗后UC模型小鼠外周血中CD4+Foxp3+T细胞荧光强度较DSS组降低,提示美沙拉嗪能下调UC模型小鼠外周血中Treg细胞中Foxp3的表达。进一步检测发现,美沙拉嗪能显著下调UC模型小鼠肠组织中Th1、Th17和Treg亚群。对uc病理变化的预测溃疡性结肠炎是一种原因不明的直肠和结肠炎症,是危害人类健康的慢性疾病之一,据世界卫生组织报告,该病发生率为1/10000~2/10000,在我国UC的患病率约为1.16/10000,实际的病例数更多。因此,对于UC发病的研究及治疗方法的探讨也成为医疗卫生界的重要课题。以往的研究认为UC的发生发展与IL-4、IL-5、IL-13等介导的Th2型免疫反应密切相关,近期研究认为产生IL-17的Th17型细胞、产生IFN-γ的Th1型细胞以及Foxp3+Treg细胞均在UC的发病中发挥重要作用。IL-17是新近发现的一种促炎症细胞因子,其具有强大的促炎反应活性,在不同的疾病中发挥着不同作用。有文献报道IL-17通过IL-17/IL-23轴参与炎症性肠病的发生,研究显示在炎症性肠病患者中IL-17的产生较正常人明显增加,这在小鼠溃疡性结肠炎模型中也得到了证实。IFN-γ是Th1细胞亚群产生的主要细胞因子,这类细胞因子在疾病中的研究及其作用机制都比较明确,在UC发病中IFN-γ起重要作用,本研究结果显示:尽管UC小鼠模型外周血中Th17和Th1细胞与对照组无显著差异,但在肠组织中产生Th17和Th1细胞亚群均显著增高,说明Th17和Th1细胞在UC肠道局部炎症损伤中起重要作用。调节性T细胞是一组具有免疫负调节作用的T细胞亚群,它在维持机体免疫平衡、形成外周免疫耐受过程中发挥重要作用。Treg细胞可在体外通过细胞接触依赖机制参与炎症反应,另外Treg细胞表达高水平的细胞毒T淋巴细胞相关抗原4与抗原提呈细胞上的B7结合,诱导色氨酸裂解酶-吲哚胺2,3-二加氧酶活化,介导免疫耐受。同时Treg细胞还可通过调节释放抑制性细胞因子(IL-10等)参与UC的发病,其数量较少或者功能异常均可导致疾病的发生。王晓红等在研究大黄、巴豆霜对三硝基苯磺酸诱导的UC大鼠模型中发现在模型组大鼠外周血Treg细胞的百分比显著降低;周红光等在对三硝基苯磺酸诱导的UC大鼠模型研究中发现其模型组外周血及肠系膜淋巴结中CD4+CD25+Treg细胞显著降低;Chao等在UC患者中发现Treg细胞比例低于健康人;谭至柔等在UC患者外周血中也发现了这一现象。另外在T细胞缺乏的小鼠体内输注CD45RBhighCD4+T细胞可诱导形成炎症性肠病模型,同时可以调节Th1型T细胞产生IFN-γ的效应,这证实了Treg细胞减少或功能异常均可导致UC的发病。但是也有部分研究认为Treg细胞在炎症状态下代偿性增加,与Th17细胞亚群呈现协同状态,参与炎症反应。有报道在活动性溃疡性结肠炎患者外周血中Treg细胞明显高于健康人,且活动性溃疡性结肠炎比慢性溃疡性结肠炎外周血Treg细胞升高。另外也有研究证实在小儿UC和克罗恩病中,Treg细胞数量较正常人升高,Rismo等在UC成年患者中也证实了这点。本组实验研究发现在外周血Treg细胞和病变局部肠道组织中Treg细胞水平均较正常对照组升高,这可能与小鼠体内环境不同,炎症细胞因子数量优势不同相关,在炎症状态下大量淋巴细胞浸润,调节性T细胞也代偿性增加,但是其增加水平无法抗衡促炎因子增加水平,从而发生炎症反应。同时这也提示在溃疡性结肠炎小鼠中,由于Treg细胞的异常,可能导致机体免疫失衡,从而使效应性CD4+T细胞从循环系统向肠道局部炎症部位移行,富集于炎症损伤部位,从而导致消化道黏膜处于高度活化状态,诱发机体肠道免疫反应,从而导致对自身抗原不耐受,损伤性细胞因子释放增加,导致黏膜损伤。因此,我们认为Treg细胞失衡在溃疡性结肠炎发病中发挥重要作用。这与郭敏等在大鼠模型中的研究报道一致。另外国外有文献报道在UC患者外周血、结肠组织及肠系膜淋巴结等检测发现其Treg细胞较正常人升高,其可能的机制是结肠组织或肠系膜淋巴结组织中增加的Treg细胞在体内可能通过某些共刺激分子或Toll样受体信号途径其抑制效应T细胞的功能被抑制,因此,即使在体外实验发现其外周血和病变组织中Treg细胞升高,这种升高仍不能逆转疾病的发生及发展,其具体机制目前暂未明确。因此,我们认为在UC小鼠外周血和病变结肠组织中升高的Treg可能在不同程度上限制疾病的发展,但是不能逆转疾病的发生。美沙拉嗪是一种新型5-氨基水杨酸控释剂,是治疗溃疡性结肠炎的首选药物之一,特别适用于对柳氮磺吡啶不能耐受的患者的急性发作。本组实验采用美沙拉嗪微胶颗粒予小鼠灌胃,结合文献报道采用中剂量用量预治疗小鼠溃疡性结肠炎能有效减轻小鼠肠道炎症,因此本组实验选用中剂量灌胃治疗。结果发现,采用美沙拉嗪治疗小鼠7d后结肠组织炎症渗出较少,隐窝及腺体结构清晰,炎症程度较DSS诱导的UC小鼠组轻,其临床疗效显著。因此,我们认为美沙拉嗪灌胃预治疗能有效降低肠道炎症。而其作用的机制暂未完全明确,有研究认为其主要是通过作用于肠道炎症黏膜,抑制引起炎症的前列腺素的合成和炎症介质白三烯的形成,清除氧自由基,抑制肠黏膜的脂肪酸氧化,降低肠上皮通透性,从而对肠道壁炎症起显著的消炎作用,对发炎的肠壁结缔组织效果尤佳。其免疫学机制研究较少,有报道认为其可能通过抑制结肠组织下调NF-κB的表达,减少结肠局部炎性细胞因子的产生,最终达到治疗溃疡性结肠炎的目的;也可能通过影响其它细胞因子或信号转导途径发挥抗炎作用,然而美沙拉嗪对T细胞亚群的研究较少,且机制暂未明确。本组实验研究发现美沙拉嗪预治疗后UC小鼠炎症减轻,且预治疗组小鼠外周血分泌IFN-γ的Th1细胞活性降低,这提示美沙拉嗪可能调节Th1细胞活性。有研究显示美沙拉嗪释放一氧化氮衍生物NCX-456,而这种NCX-456可抑制Th1细胞诱导的细胞因子的释放,同时促进抑炎因子的产生,在UC中发挥重要的抗炎作用,且NCX-456能抑制细胞增殖,导致活化的肠黏膜固有层Th1细胞选择性凋亡,从而达