黄芩苷和黄芩素在大鼠胃肠吸收动力学研究

黄芩苷和黄芩素在大鼠胃肠吸收动力学研究

黄鼠狼的主要成分是黄鼠狼。它具有广泛的抗癌、抗炎、抗菌、抗癌、抗癌等药物特性。研究表明,黄芩苷是黄芩素的复原型前体药物,即:黄芩苷在肠内经过菌群作用转化为黄芩素而吸收,然后再于体内还原为黄芩苷。因此全面比较黄芩苷和黄芩素在各部位的吸收情况,了解它们在各肠段的吸收特征,对提高其口服生物利用度和开发口服制剂具有重要意义。1材料和方法1.1药品、试剂和仪器HPLC仪器为LaballianceSeriesⅢ型等度系统:SeriesⅢ型泵、Model500型UV-Vis检测器和7725i进样阀;HL-2型恒流蠕动泵(上海青浦沪西仪器厂)。黄芩苷和黄芩素对照品由中国药品生物制品检定所提供,批号分别为110715-200212和111595-200301;黄芩苷提取物由成都福润德实业有限公司提供,批号为041015,≥90%(HPLC);黄芩素提取物由成都欧康植化科技有限公司提供,批号为041128,≥95%(HPLC)。甲醇为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。Wistar大鼠,雄性,体重200g左右(四川大学华西实验动物中心)。1.2黄鼠狼的吸收1.2.1进一步的浓度人工胃液的配制:按《中国药典》2005年版二部附录配制含胃蛋白酶的人工胃液。Krebs-Ringer试剂(pH7.4,简称K-R试液)的配制:称取NaCl7.8g,KCl0.35g,CaCl20.37g,NaHCO31.37g,NaH2PO40.32g,MgCl20.02g,葡萄糖1.4g,加水定容至1000mL,即得。黄芩苷乙醇溶液的配制:精密称取黄芩苷提取物84.89mg,用无水乙醇稀释定容至50mL,即得。黄芩素乙醇溶液的配制:精密称取黄芩素提取物80.1mg,用无水乙醇稀释定容至50mL,即得。黄芩苷胃灌注液的配制:精密吸取上述黄芩苷乙醇溶液2mL,再精密加入Tween80(10%)5mL,用人工胃液稀释定容至100mL,即得。黄芩素胃灌注液的配制:精密吸取上述黄芩素乙醇溶液2mL,再精密加入Tween80(10%)5mL,用人工胃液稀释定容至100mL,即得。黄芩苷肠灌注液的配制:精密称取黄芩苷提取物33.8mg、酚红20.0mg和维生素C2.0g,再精密加入无水乙醇20mL及Tween80(10%)10mL,用K-R试液稀释定容至1000mL,即得。黄芩素肠灌注液的配制:精密吸取上述黄芩素乙醇溶液20mL,再精密加入Tween80(10%体积比)10mL、酚红20.0mg及维生素C2.0g,用K-R试液稀释定容至1000mL,即得。酚红液:精密称取酚红20.00mg和维生素C2.0g,然后加入乙醇20mL及Tween80(10%体积比)10mL,用水定容至1000mL,即得。1.2.2在体吸收实验中1.2.2.胃灌注液制备选实验前禁食1夜(自由饮水),体重200g左右的Wistar大鼠,腹腔注射戊巴比妥钠40mg·kg-1,麻醉后固定。切开腹部,暴露胃,在贲门、幽门两处各切一小口,结扎贲门,用人工胃液将胃洗净。吸取胃灌注液4mL并注射到胃内,结扎幽门。将胃放回腹腔,用红外灯保持体温37℃左右。胃灌注液中药物浓度为初始浓度。2h后取出胃,将胃内药液转移置10mL量瓶,用人工胃液少量多次地洗涤胃内部,洗液一并转入上述量瓶,最后用人工胃液定容,摇匀。此量瓶中药物浓度作为终浓度,根据药物初始药量和终末药量之差(初始浓度×初始体积-终浓度×终体积)与时间的比值计算其每小时吸收率。1.2.2.固结玻璃管制备选实验前禁食1夜(自由饮水),体重200g左右的Wistar大鼠,腹腔注射戊巴比妥钠(40mg·kg-1),麻醉后固定。沿腹中线打开腹腔(约2.5cm),于实验肠段两端各切一小口,在上端小口处插入直径为0.3cm的玻璃管,并用线扎紧。用注射器将37℃的生理盐水缓缓注入肠管,洗去肠管内容物至净。然后在实验肠管下端小口处插入玻璃管,并用线扎紧。将肠管两端的玻璃管与蠕动泵的胶管连接,形成回路,开动蠕动泵。肠灌注液以5mL·min-1流速循环10min后,将流速调节为2.5mL·min-1,立即自灌注液锥形瓶中取样1mL,同时向锥形瓶中补加酚红液1mL,其后每隔15min亦按同法取样并补加酚红液,循环2h后,中止实验。样品10000r·min-1离心5min,取上清液20μL用HPLC法同时测定黄芩苷、黄芩素和酚红的浓度,根据Fick方程原理对药物浓度改变进行拟合,求药物的吸收参数。2保肝作用大鼠肠道吸收引物多态性测定以黄芩苷和黄芩素的胃灌注液进行在体胃吸收实验,肠灌注液进行在体肠吸收实验,分别得到黄芩苷和黄芩素在大鼠胃、小肠(100cm)和结肠(10cm)的每小时吸收率,结果见表1。本实验进一步考察了黄芩素在大鼠十二指肠、空肠、回肠和结肠的吸收情况,表2为黄芩素在各肠段(10cm)的吸收参数。对黄芩苷在小肠和结肠的每小时吸收率作t检验,P<0.05,差异有统计学意义,表明黄芩苷在小肠和结肠虽均基本不吸收,但结肠仍优于小肠。对黄芩素在各肠段的吸收速率常数(ka)作t检验,十二指肠、空肠和回肠的ka间差异均无统计学意义,结肠与以上各肠段的ka间差异均有统计学意义。结果表明黄芩素在十二指肠、空肠和回肠的吸收速率相近且均优于结肠。3对药物稳定性的影响大鼠在体吸收实验是研究药物胃肠吸收的重要方法,但是本法只限于溶解性较好、能够以水溶液状态给药且稳定、不被胃肠道吸附和代谢的药物。黄芩苷和黄芩素均难溶于水,且尤其不溶于人工胃液的酸性环境。在配制灌注液时,本实验选用了增溶的方法:即先用少量乙醇溶解药物,使之呈分子分散状态后再加入增溶剂Tween80液(10%体积比),最后再以人工胃液或K-R试液稀释定容。另外,由于黄芩苷和黄芩素在K-R试液中易被氧化,经抗氧效果比较,肠灌注液中选择VitC作为抗氧剂。为了简化实验,减少实验步骤,本实验分别建立了胃、肠灌注液中黄芩苷和黄芩素的同时测定法,并分别进行了方法学的考察。黄芩苷和黄芩素在胃、肠灌注液中的稳定性实验表明,使用本实验用量的增溶剂和抗氧剂可以得到澄明稳定的胃、肠灌注液(2n×2=2×3×2)。黄芩苷和黄芩素的胃、肠吸附实验表明,药物在胃肠道无物理吸附、代谢及摄取(2n×2=2×3×2)。黄芩苷存在体内菌群代谢,参与代谢的菌群为厌氧菌群,多分布于盲肠和结肠。黄芩苷在结肠的吸收优于小肠,由于小肠的长度数倍于结肠,故其在结肠单位时间单位长度的吸收远好于小肠,这可能是由于黄芩苷在结肠菌群作用下转化为更易被吸收的黄芩素而加速了吸收。黄芩素在胃、小肠以及结肠的吸收均明显好于黄芩苷,虽然被吸收的部分黄芩素可再以黄芩苷的形式被分泌回到小肠(待发表资料),结果仍然提示黄芩素比黄芩苷更适合制成口服吸收