二氢杨梅素的分离、鉴定及其生物活性

二氢杨梅素的分离、鉴定及其生物活性

二羟基杨梅素是一种多酚羟基双羟黄酮醇（结构见以下描述）。该化合物最初由kotaka和kubota从属植物的福建茶（a.meliaen）中分离，称为蛇葡萄糖素。1996年周天达等从藤茶的茎叶中再次分离得到该化合物,并命名为DMY。研究表明藤茶茎叶中DMY含量可达30%以上。藤茶,学名显齿蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata),是葡萄科蛇葡萄属的一种野生藤本植物,主要分布于广西、广东、云南、贵州、湖南、湖北、江西、福建等省区,集中或散生在海拔400～1300m山坡的混交林中。野生贮量大,分布和生长规律比较清晰,是极为丰富和可利用的野生植物资源。1生物活性1.1dmy与其他有机溶剂的反应后效果比较林建峰等证实DMY对小鼠巴豆油性耳廓水肿、大鼠角叉菜胶性、甲醛性足跖肿胀及腹腔毛细血管通透性、急性、亚急性炎症的渗出过程均有抑制作用;小鼠醛酸性扭体反应和热水反应显示有一定的镇痛作用,能提高小鼠的痛阈水平。钟正贤等研究结果表明:DMY组(1.0g·kg-1,0.5g·kg-1)和阳性对照药氯化胺(1.0g·kg-1)的酚红排泌量与对照组比较均有明显升高,证实DMY有明显的止咳祛痰作用。同时,DMY能明显延长咳嗽潜伏期和减少咳嗽次数,其中大剂量组(1.0g/kg)的止咳作用强度与对照组咳必清相当。杨书珍等进行了DMY和几种食品常见菌的抑制效果的研究,结果表明:DMY对牛奶酸败菌和青霉菌具有明显的抑制作用,且抑菌效果优于常见的防腐剂苯甲酸。萧力争等实验发现DMY对细菌有较强的抑菌活性,最低抑菌浓度不超过1.76g/L,在酸性或弱碱性环境中比在中性和强碱性环境下的抑菌活性更强。Matsumoto等在进行植物次生代谢物抑制真菌筛选实验中发现,DMY对ladosporiumherbarum真菌具极强的抑制作用,若将DMY修饰为甲酯,则其甲酯的抑菌能力为DMY抑菌能力的4倍。1.2dmy对大鼠肝脏毒性的作用Oshima等先后证实DMY表现出明显的抗四氯化碳和半乳糖胺所致的肝损伤和抗肝炎毒素作用。Hase等用DMY进行了通过铁酸刺激引起的老鼠肝损伤的实验。结果表明,DMY可以减少LDH高水平的自发发生以及由铁酸刺激而引起的LDH高水平释放,其程度接近由抗氧化剂(SOD、丙酮酸盐酯和二甲亚砜)所引起的水平。DMY对体外培养的大鼠肝细胞四氯化碳中毒性损伤、D-半乳糖胺和脂多糖诱导的小鼠肝损伤有显著的保护作用。也有报道认为DMY有肝细胞毒性作用。DMY护肝机理已基本明确,主要是其可抑制肝性M细胞胶原纤维的形成,从而达到治疗肝病的目的。在老鼠肝细胞组织培养中,肝细胞移植后很容易产生胶原纤维,而DMY可抑制胶原纤维的形成,已形成的胶原纤维则被分散成小微块。1.3dmy作酒精神Hase等在进行解除酒精中毒剂实验中得出DMY解除酒精中毒效果最佳;DMY减轻乙醇中毒的原理主要是保肝护肝。乙醇的代谢物乙醛是造成酒后头昏和恶醉的主要原因,是给肝脏带来损害的主要物质,而DMY可以加速乙醛迅速分解为无毒物质,降低对肝细胞的损害。同时它起效迅速,作用持久,是解酒醒酒的良品。刘建新等用显齿蛇葡萄植物水煎剂进行了解酒实验,结果显示随其水煎剂浓度的加大,跌倒反应百分率和步态不稳百分率下降,证实其具缓解酒醉反应,促进醒酒的作用,尽管他们用的不是DMY单体,但显齿蛇葡萄植物水煎剂的主要成分为DMY,说明DMY具有减轻乙醇中毒的作用。1.4dmy糖凝剂刘建新等证实了DMY拮抗去甲肾上腺素(NE)和高K+所致的兔胸主动脉条收缩,显示DMY对肠平滑肌和主动脉条的α受体具有阻断作用。周雪仙等进一步证实,DMY对NE所引起的依赖内Ca2+释放的收缩有明显的抑制作用,对NE依赖细胞外Ca2+性收缩仅在较高浓度时才显示抑制作用,提示DMY电压依赖性钙通道(PDC)有选择性阻滞作用,有望开发为抗高血压药。郑成等以D-半乳糖为诱导剂,采用剂量递增全程腹腔注射法建立糖耐量异常动物模型。以DMY为受试物,实验8w后,测定各实验组大鼠空腹及餐后2h血糖、胰岛素水平、尿微量白蛋白、尿素氮以及肾脏乳酸脱氢酶比活。结果表明:DMY可明显改善大鼠糖耐量异常状态,对肾脏早期损伤具有一定保护作用。钟正贤等采用喂高脂乳剂小鼠高血脂症模型实验证实,模型组血清TC、TG值明显升高,HDL-C值下降。与模型组比较,DMY大小剂量组均能抑制高脂乳剂引起的血脂升高,具有降脂作用,其作用强度与对照药安妥明相似。1.5基于花色素的合成在自然界中,蓝色康乃馨是非常罕见的,培育蓝色康乃馨一直受到园艺学家的重视和关注。康乃馨花表现为蓝色与否主要是由其中翠雀素苷所引起。Holton等通过花色素路线培育了蓝色康乃馨。即将DMY注入白、红和杂色康乃馨叶细胞中作底物,在胞内合适的pH(7.0)、温度(30℃)和3′,5′-二羟基黄酮还原酶作用下,DMY可转化为翠雀素苷,从而使得其花色表现为蓝色,使白、红和杂色康乃馨转化为蓝色康乃馨。其后的研究,不少学者从基因水平对此进行了解释和论证。1.6dmy的抗氧化活性已有的研究显示:DMY有明显的抗氧化活性,DPPH自由基清除试验证明DMY为3种桃榄属(Pouteria)植物中抗氧化作用的有效成分之一,并测定了人心果中分离的有效成分DMY抗氧化作用的IC50值。DMY能明显抑制油脂中MDA的生成,且随纯度增加抗氧化作用增强;对动物油和植物油均有很强的抗氧化作用。徐静娟等采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法、抗坏血酸-Cu2+-H2O2体系法和亚油酸体系法,研究了DMY的抗氧化活性,结果显示:DMY对超氧自由基O-2·、羟基自由基·OH和脂过氧自由基ROO·的清除率分别可达90.0%、83.9%和63.9%。该结果表明,DMY有较强的抗氧化能力。张志坚等实验表明:在邻苯三酚红体系中,DMY的抗氧化效果优于TBHQ,与Vc相近,在油脂和糕点的氧化过程中,具有与TBHQ相近的抗氧化效果;且DMY在12m内有较好的稳定性。张友胜等报道:DMY(0.01%～0.04%)可抑制亚油酸过氧化,其作用效果等同或优于TBHQ。DMY在FeSO4依地酸引发的亚油酸过氧化体系中的抗氧化机制为络合Fe2+,阻止由Fe2+引发的亚油酸过氧化。说明DMY有较好的抗氧化效果,有可能成为一个很好的天然抗氧化剂。何桂霞等实验表明:含量99%的DMY,浓度为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%时,对试验系统中DPPH自由基的清除率分别为73.3%、81.4%、87.7%和91.5%。1.7dmy浓度对小鼠a56黑色素瘤细胞毒性的抑制作用发挥了显DMY的乙酸化物对KB人口腔癌细胞株和MCF-7乳腺癌细胞株有很强的选择性细胞毒作用,ED50分别为0.6和2.0μg/mL。尹梅梅等实验表明,DMY可通过增加细胞内钙诱导AGZY2832a细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。用DMY浓度为20、40、80μmol/L时,能抑制体外培养的小鼠B16黑色素瘤细胞对重组细胞基底膜的侵袭,侵袭抑制率分别为36.1%、59.6%、79.1%;同时抑制B16瘤细胞的运动能力,运动能力抑制率分别为51.6%、56.5%、66.8%;降低B16瘤细胞对层黏连蛋白、纤维黏连蛋白和重组细胞基底膜的黏附,降低瘤细胞黏附的效应与DMY浓度呈正相关。郑宏强等实验得出:DMY浓度为100、200、250mg/kg时,给每只尾静脉注射2×105个B16瘤细胞的小鼠灌胃18d,能明显抑制小鼠B16瘤细胞肺转移灶,抑制率分别为31.0%、40.6%、61.2%。1.8dmy对小鼠实验的作用DMY可抑制艾滋病病毒(HIV-1)对靶细胞的吸附、共育和急性感染,能有效保护HIV-1易感细胞,抑制P24抗原表达。DMY干扰HIV-1SF33吸附MT-4细胞,其细胞保护与P24抗原抑制作用的EC50分别为0.175、0.024mg/mL,MT-4与HIV-1SF33共育时,EC50分别为0.229、0.197mg/mL,对于HIV-1SF33急性感染,EC50为0.179、0.348mg/mL。DMY能显著促进小鼠毛发上皮细胞增殖,对20-羟基脱皮甾醇有拮抗作用,拮抗20-羟基脱皮甾醇为50nmol/L浓度时的ED50为33μmol/L。杨秀芬等认为DMY能显著延长戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间,缩短潜伏期;DMY对小鼠中枢无直接作用。姜仕先利用聚酰胺法从藤茶中分离DMY,并研究其对心肌细胞的保护作用,结果流式细胞仪(FCM)检测结果显示,DMY对H2O2诱导的心肌细胞凋亡有明显抑制作用。2dmy的结构修饰DMY具有较好的亲水性和较弱的亲脂性,在pH≥9的碱性条件下易于氧化,温度的升高,Fe3+、Al3+、Cu2+等金属离子的存在以及光线均可以加速DMY氧化,这极大地限制了DMY的应用,因此有必要对其进行结构修饰。目前,一般可以采用化学法、微生物法和酶法等3种方法来进行结构修饰,其中又以化学法最为普遍。微生物法和酶法结构修饰反应条件温和,无需保护和脱保护,化学、立体和区域选择性高,但是微生物法的产物难以分离纯化,酶法虽然解决了这一问题,但是也面临着成本高、难以有效工业化的困难,这一方面目前研究报道很少。化学法选择多,反应成熟,控制方便,所以是目前采用的最普遍的分子结构修饰方法。DMY的结构修饰主要可分为以下几个方面:1)糖苷化修饰;2)酯化修饰;3)金属离子螯合修饰。2.1糖苷化的作用糖苷化修饰具有的特点:1)可以改变药物分子的亲脂性、电性或空间立体位阻,从而改善药代动力学性质,增强生物活性;2)糖类亲水性强,透膜能力有限,通常在细胞表面及细胞间质发挥作用,因而可以降低常规药物的细胞内毒副作用;3)糖苷化修饰的化合物大多水溶性增大,具有良好的内吸性,易于为人体接受、吸收,由此可大大提高生物利用度;4)糖苷比之其苷元往往挥发性降低、稳定性增强,有利于药物的缓释吸收;5)糖苷化修饰后的化合物具有对某些类型细胞的特异性寻靶性质,提高了对作用受体亚型的选择性,从而可以大幅度降低毒副作用,改善疗效。因此,将DMY进行糖苷化修饰,可能会大大提高其生理活性,开发出一些有前途的新药。宁正祥等运用从腐乳发酵菌群中筛选出一株产生黄酮糖苷酶的黑曲霉菌株。在底物DMY质量浓度为80g/L,蔗糖质量浓度为300g/L,酶用量为5000μ·L-1活力单位,pH5.0,40℃下反应20h,合成了DMY葡萄糖苷,产率为53%,并对158例糖尿病患者进行了为期9m的口服治疗,发现DMY葡萄糖苷可使糖尿病患者的血糖代谢基本回归到正常水平。2.2dmy脂肪酸酯化学成分李卫等研究发现:DMY分子6个羟基发生酯化反应的难易程度为:3-OH>4′-OH>5′-OH>5-OH>3′-OH>7-OH;由DMY各羟基自由基生成热计算结果,可以得出6个羟基抗氧化大小依次为4′-OH≈5′-OH>3′-OH>7-OH>5-OH>3-OH。所以,对DMY抗氧化活性较低的羟基进行酯化修饰,保留活性较高的羟基和黄酮分子特有的结构部分,使之在具有抗氧化性的同时又具备亲脂性,更好地在生物体内发挥作用是一个值得研究的课题。Matsumoto等合成了DMY甲酯,发现其抑菌能力为DMY母体抑菌能力的4倍。张友胜等合成了DMY硬脂酸酯,发现酯在亚油酸体系中的抗氧化作用大小随着添加量的增加而增加。在同等添加量的作用下,其阻止作用强于BHT,添加量为0.05%的DMY硬脂酸酯的抗氧化作用基本等同于0.02%的TBHQ的抗氧化作用。李卫等得出DMY月桂酸酯能够持久、稳定地在猪油中发挥抗氧化作用,在猪油中的抗氧化能力比DMY强。肖更生等提供了一种能溶于脂类化合物体系的DMY脂肪酸酯的制备办法,制备的DMY脂肪酸酯,在具备原水溶性DMY功能的同时,能溶于各种脂类化合物体系,该方法已经获得了发明专利。胡春菊等的研究也表明,通过对DMY进行乙酸酯的酯化改性,能明显地提高DMY的抗氧化作用能力。2.3氢杨树叶片的oh自由基清除率孟燕进行了DMY与Zn2+、Ca2+和Fe3+形成配合物的研究。结果表明,在抗氧化活性方面,DMY锌配合物和钙配合物都有较理想的·OH自由基清除效果,清除率在80%以上;铁配合物的清除率很低,不到20%。近期吴春等也进行了二氢杨梅素与锌配合反应的研究。郭清泉进行了DMY螯合金属离子Fe的实验,结果表明,铁-DMY螯合物能够消除金属离子对自由基氧化的催化作用,以增加DMY的稳定性,还可以作为铁强化食品,起到补充和强化人体铁元素含量的目的,同时又不改变DMY的抗氧化活性。3dmy在生物活性成分研究中的应用我国的DMY资源丰富、来源广泛、生物活性较强,具有很高的开发利用价值。众所周知,黄酮类化合物具有较低的毒性和广谱的药理活性,是新药研发的活性先导物的来源宝库。对具有活性的