二氢杨梅素对几种食品微生物的抑菌效果

二氢杨梅素对几种食品微生物的抑菌效果

微生物污染是影响食品和安全的主要因素之一。据估计，世界上大约10%或20%的食品损失在腐败后。添加食品洗涤剂仍然是防止食品腐败和恶化质量的重要手段之一。目前普遍使用的化学防腐剂存在一定的安全隐患。天然防腐剂是从植物、动物、微生物代谢产物提取的抗菌活性物质,具有广谱、高效、低毒等化学防腐剂无法比拟的优点,因而越来越受到人们的青睐,已成为天然产物开发和食品加工研究领域的热点。显齿蛇葡萄俗称藤茶,是葡萄科蛇葡萄属的一种野生木质落叶藤本植物。不少学者对藤茶的化学成分进行了较深入的研究,证实藤茶的主要成分为二氢杨梅素。二氢杨梅素具有很强的氧化能力,能有效抑制细菌等微生物的生长。以往的研究多集中在藤茶和二氢杨梅素的药理药效等功能方面,本研究较深入地探讨了二氢杨梅素对常见的食品腐败菌的抑菌活性及其作用条件,旨在探讨藤茶提取物二氢杨梅素作为天然食品防腐剂的可能性。1材料和方法1.1实验材料1.1.1样品1.1.2不同病原菌的引起对酵母菌种的认识湖南农业大学微生物实验室提供,其中细菌有大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、溶血性链球菌(Hemolytictreptococcus),霉菌有青霉(Penicilliumsp)、黑曲霉(Aspergillusniger),酵母有啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。1.2实验方法1.2.1准备圆形滤纸将滤纸片用滤纸打孔器制成直径为6.5mm圆形小滤纸片,高温蒸气杀菌后烘干备用。1.2.2原料、消毒和样品制备实验中的细菌培养基和真菌培养基的制备、灭菌及平皿制备均参考文献中方法进行。1.2.3供试菌的制备细菌、酵母菌、霉菌悬液的制备:用接种环分别挑取3~4环培养1d的各供试菌于带玻璃珠的装有90mL无菌生理盐水(0.85%)的三角瓶内,振荡均匀,制成菌悬液。用稀释平板记数法和血球记数板测定菌数,调整菌悬液浓度,使其菌悬液浓度为106~107cfu/mL,现配现用。1.2.4抑菌圈直径测定将样品用76%乙醇溶解,配成质量浓度分别为7.04、10.56、13.20g/L的二氢杨梅素乙醇溶液,倾少量于已灭菌的瓶内。将已灭菌烘干的圆滤纸片浸入不同浓度的溶液中6~8h后,用无菌镊子夹出,贴于含菌平皿中。一个平皿贴3片含样品药液的滤纸片,呈正三角形。平皿中间贴一个用76%乙醇浸泡同样长时间的滤纸片,作为对照。将加好药液的平皿置恒温培养箱中培养,细菌于37℃培养24h,酵母、霉菌于28℃培养48h,取出观察,测定抑菌圈直径。重复3次。1.2.5最低抑菌浓度测定按文献介绍的试管2倍稀释法进行。具体操作是:取6支试管,于每一支试管内加入培养液2mL(灭菌121℃,30min)。吸取2mL药液(二氢杨梅素浓度为7.04g/L)到第1管内,充分混匀后吸出2mL到第2管中,依次稀释到第6管。第6管充分混匀后吸出2mL混合液丢弃。再向每一管内分别加菌悬液0.05mL(菌液浓度106~107cfu/mL)摇匀后细菌置37℃培养24h取出观察。以能抑制细菌生长繁殖的药液最高稀释度为该药的最低抑菌浓度。将上述稀释度在MIC以前(包括MIC)的各菌药混合管取0.1mL转接于琼脂平板上,用无菌玻璃刮铲涂抹均匀后,细菌于37℃培养24h,酵母、霉菌于28℃培养48h,取出观察结果,以仍没菌生长的最高药物稀释度为该药的最低杀菌浓度,重复3次。1.2.6不同ph下二氢杨树叶片的抑菌效果将质量浓度为10.56g/L二氢杨梅素用氢氧化钠和盐酸调成6个pH梯度(3~4、4~5、5~6、6~7、7~8、8~9),用上述1.2.4介绍的方法做抑菌圈的测定,观察不同pH下二氢杨梅素抑菌效果的变化,重复3次。1.2.7温度对二氢杨树莓原汁抑菌活性的影响将二氢杨梅素用76%乙醇稀释成质量浓度为10.56g/L的药液,药液121℃处理10min,用上述1.2.4介绍的方法观察温度对二氢杨梅素抑菌活性的影响,重复3次。2结果与分析2.1不同菌种的抑制作用本研究的结果显示,不同质量浓度的二氢杨梅素对供试的霉菌和酵母无明显的抑制作用,而对各种供试的细菌,无论是球菌和杆菌,革兰阴性菌和革兰阳性菌,都有明显的抑制效果,结果见表1。2.2抑菌浓度的测定由表2可知,二氢杨梅素对各种供试细菌具有较低的抑菌浓度,对枯草芽孢杆菌和链球菌的最低抑菌浓度为1.74g/L,对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.22g/L,而对金黄色葡萄球菌的抑菌浓度更低,小于0.11g/L。由表3可知,样品对链球菌和枯草芽孢杆菌的最低杀菌浓度高于3.52g/L,对大肠杆菌和金黄色葡萄球的最低杀菌浓度分别是1.74g/L和0.88g/L。从表2和表3数据分析,二氢杨梅素具有广谱抑菌、杀菌的效果,其最低抑菌浓度和最低杀菌浓度较低,这些指标显示了其作为天然食品添加剂的前景。2.3酸性环境内二氢杨树莓原汁酸性温度对抑菌活性的影响由表4可知,pH对二氢杨梅素抑菌活性的影响较大,在不同的pH环境下,二氢杨梅素对不同细菌的抑菌活性有差异,但总的来说,其在酸性环境中抑菌活性较强。二氢杨梅素抑菌活性在偏酸性的条件下比中性及碱性条件下的抑菌作用较强的原因,可能是在酸性条件下,细菌对外界不良环境的抵抗力减弱,增强了二氢杨梅素的抑菌效果;另一方面,二氢杨梅素的化学结构在酸性条件下电离程度增大,使其溶解性能增加,导致有效浓度增加,从而抑菌效果更佳。2.4高温对二氢杨树莓原汁抑菌圈和稳定性的影响用10.56g/L的二氢杨梅素溶液在121℃条件下处理10min后,4种菌的平均抑菌圈直径与表1中同浓度溶液抑菌圈直径基本相同,说明高温作用后,二氢杨梅素的抑菌活性基本没有变化,二氢杨梅素具有良好的热稳定性。3氢杨素的抑菌效果熊大胜等人用显齿蛇葡萄幼嫩茎叶提取物进行抑菌实验结果表明,其对金黄葡萄球菌、枯草杆菌均有很强的抑制作用,对黑曲霉、黄曲霉、青霉等均有不同程度的抑制效果。熊皓平等人的研究结果是藤茶醇提取物对各种真菌均表现出一定的抑制效果。杨书珍等的研究表明:二氢杨梅树皮素对牛奶酸败菌和青霉菌具有明显的抑制作用,对酵母菌的抑制效果不显著。从本研究的结果看,二氢杨梅素对酵母和霉菌的抑制效果不明显,对细菌有较强的抑制作用。各研究结果基本上都说明二氢杨梅素对细菌有较强的抑制作用,但对酵母和霉菌的抑制效果各研究的结果并不一致。这些实验结果不一致的原因可能是所采用的实验样品的来源和有效成分含量不同所致,熊皓平采用的是显齿蛇葡萄鲜叶的95%乙醇浸提物,熊大胜等人采用的是显齿蛇葡萄幼嫩茎叶提取物。不同的提取方法和纯化程度不一样可能导致样品中的有效成分含量不一,另外,显齿蛇葡萄其他成分的抗菌活性或者对二氢杨梅素对抗菌活性是否存在增效作用也是值得研究的问题。二氢杨梅素集抑菌、保健作用于一体,具有作为天然食品添加剂开发的潜力,但由于二氢杨梅素微溶于水而溶于乙醇,未来如用二氢杨梅素来作为食品添加剂开发时,应考虑二氢杨梅素在食品中的溶解性。