桑叶总黄酮对高脂诱导大鼠高脂血症、高脂血症的早期防治作用

桑叶总黄酮对高脂诱导大鼠高脂血症、高脂血症的早期防治作用

黑莓是黑莓科植物的干燥叶子。它又冷又甜又苦。具有散风、润肺、润肝、明肝的功效。这是中药之一。现代药理研究证明桑叶具有降血糖、降血脂、降血压、抗菌和抗病毒等多种药理活性,其药理活性与防治高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、肥胖症等慢性病及延年益寿密切相关,桑叶的药理活性成分多样,如有黄酮、生物碱、多糖、氨基酸、维生素和微量元素等,其中黄酮类成分是桑叶的主要成分,笔者前期从桑叶提取物中分离得到含量达54.2%的桑叶总黄酮(totalflavonoidsofmulberryleaf,FML),为进一步开发利用这一植物资源,本实验研究采用高脂饲料喂养的同时给予桑叶总黄酮预防性给药,当模型组大鼠产生高脂血症时,再联合小剂量链脲佐菌素(STZ),探讨桑叶总黄酮早期干预对大鼠体质量、血脂、FPG、SOD、MDA、LDL-C、HDL-C(动脉硬化指数)的影响,为进一步防治由高脂血症引起的糖尿病及冠心病、脑卒中等高危心血管疾病有着积极的意义。1材料表面1.1实验动物中心提供雄性Wistar大鼠,180~200g,湖北省实验动物中心提供,质量合格证号:NO.00005893,许可证号:SCXK(鄂)2008-0005。1.2脂必妥—药品与试剂桑叶饮片,武汉九州通药材公司,批号:20081001;芦丁对照品,中国药品生物制品检定所,批号:100080-200306;脂必妥,成都地奥制药集团有限公司,批号:0904018;高脂饲料:含5%蛋黄粉、10%猪油、2%胆固醇、0.2%胆酸钠、20%白糖、62.8%基础饲料,湖北省实验动物中心提供;血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、SOD、MDA、FPG测定试剂盒,均由南京建成生物工程公司生产。1.3仪器、设备和水浴锅T6新世纪紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;TU-1900双光束紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;RE-52AA旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵,巩义市予华仪器有限责任公司;HH-6数显恒温水浴锅,国华电器有限公司;台式冷冻离心机,军事医学科学院实验仪器厂。2模型的建立及给药2.1桑叶总黄酮的制备桑叶饮片购自武汉九州通药材公司;用15倍量(V/m)75%乙醇回流提取3次,每次2h,提取液浓缩,所得浓缩液静置过夜,取上层溶液上SP825大孔吸附树脂柱,先用去离子水洗脱去除水溶性杂质,再用10%、60%、95%乙醇梯度洗脱,取60%乙醇洗脱液浓缩,再用正丁醇萃取,正丁醇萃取部分经聚酰胺树脂柱精制得桑叶总黄酮,以芦丁作为标准对照品,紫外光谱扫描确定桑叶总黄酮在420nm处有最大吸收峰,经紫外分光光度法测定纯度不低于50%。2.2动物模型的分组及给药取雄性Wistar大鼠60只,以基础饲料预饲7d,称体质量后将大鼠随机分为6组,每组10只,Ⅰ组为正常对照组,Ⅱ组为高脂模型组,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组为桑叶总黄酮低、中、高剂量组(50、100、200mg/kg),Ⅵ组为脂必妥阳性对照组(1.5g/kg)。Ⅰ组给予基础饲料,其它5组给予高脂饲料。每天下午Ⅰ、Ⅱ组灌胃蒸馏水2mL,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组按剂量灌胃桑叶总黄酮2mL,Ⅵ组按剂量灌胃脂必妥2mL。每周称1次实验动物的体质量。连续给药4w后禁食不禁水12h,断尾取血,测量血脂指标,模型组达到高脂血症后,各组动物禁食不禁水12h,正常对照组腹腔注射0.1mol/L,pH=4.4的柠檬酸缓冲液,其余各组腹腔注射0.1mol/L,pH=4.4的柠檬酸缓冲液溶解的STZ30mg/kg,给药体积均为5mL/kg,腹腔注射STZ后再继续给药1周,分别在注射STZ后3、5、7d检测血糖变化;采血完毕后处死,迅速取出肝脏,称量质量,40%福尔马林固定,石蜡包埋、切片、HE染色。2.3统计学处理实验数据以ˉx±s表示,用SPSS11.5软件分析,组间差异用单因素方差分析,组间两两比较用t检验,P<0.05为有统计学意义。3结果3.1高脂模型大鼠体质量比较结果见表1。实验周期结束后,各组大鼠体质量均有不同程度增长。高脂模型组大鼠体质量显著高于正常对照组(P<0.01)。桑叶总黄酮高剂量组的体质量在各时间点均显著低于高脂模型组(P<0.01)。3.2hdl-c、hdl-c水平结果见表2。高脂饲料造模4w后可使模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C、TC/HDL-C显著升高(P<0.01),HDL-C水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较,桑叶总黄酮高剂量组血清TC、TG、LDL-C、TC/HDL-C水平显著降低(P<0.05或P<0.01),HDL-C水平显著提高(P<0.05),说明桑叶总黄酮对高脂血症大鼠有明显的调血脂作用。3.3桑黄酮对大鼠血清中mda、sod、mda的活性检测结果见表3。高脂饲料造模可使模型组大鼠血清SOD活性显著降低(P<0.01),MDA含量显著升高(P<0.05),与模型组比较,桑叶总黄酮高剂量组血清中SOD的活性显著升高(P<0.05),MDA的含量显著降低(P<0.05),说明桑叶总黄酮对高脂血症大鼠有明显的抗氧化活性。3.4物血糖检测结果见表4。模型组、桑叶总黄酮低、中、高剂量组、脂必妥组各组动物血糖在腹腔注射STZ后均有上升趋势,与正常对照组比较,模型组大鼠血糖显著升高(P<0.01);与模型组比较,桑叶总黄酮高剂量组大鼠血糖著性降低(P<0.05或P<0.01)。3.5黄酮对大鼠肝组织结构的影响肉眼观察:正常对照组大鼠肝脏无异常变化。模型组肝脏体积明显增大,包膜紧张,边缘圆钝,并见局灶性黄白色变性灶,切面油腻。桑叶总黄酮高剂量组和脂必妥组大鼠肝脏体积较正常对照组略大,包膜紧张,边缘薄,肝脏表面奶黄色的点状物较少,触之柔软。显微镜显示:正常对照组大鼠肝组织结构完整、清晰,肝小叶结构正常,肝细胞排列成肝索(见图1A);模型组大鼠肝组织可见中到重度脂肪肝,以肝腺泡区为主的弥漫性肝细胞空泡变性,肝细胞排列紊乱(见图1B)。黄酮低、中剂量组大鼠肝组织脂肪变性程度较模型组降低,仍然有弥漫性的细胞空泡变性,空泡体积变小明显(见图1C、D)。黄酮高剂量组和脂必妥组的肝组织结构清晰,脂肪变以轻度为主,仅有少量散在的细胞空泡(见图1E、F)。A.正常对照组B.模型组C.桑叶总黄酮低剂量组D.桑叶总黄酮中剂量组E.桑叶总黄酮高剂量组F.脂必妥组4对大鼠血清fpg、tc、tg、ldl-c、fpg、fpg、tbg、tbg、tbg、fpg、fpg、tbg、tba、hl-c、fpg、tba、hl-c、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、hl-c、fpg、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、fpg、hl-c、fpg、fpg、fpg、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、hl-c、fpg、tg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、tg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、hl-c、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg、tg、fpg、fpg、fpg、fpg、fpg高脂血症是糖尿病及大多数心血管疾病发生和发展的主要危险因素之一。脂质的异常,尤其是血清TC、TG及LDL-C升高、HDL-C降低,在心血管疾病的发病中具有重要意义。本研究采用高脂饲料造模后可使模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C显著升高,联合应用小剂量STZ后,模型组FPG显著升高,实验结果表明桑叶总黄酮可显著降低高脂诱导的大鼠血清FPG、TC、TG、LDL-C、的水平,提高HDL-C的水平,并使动脉粥样硬化指数(TC/HDL)显著降低,并呈现剂量依赖性,提示其对糖尿病及心血管系统疾病有一定预防作用,说明桑叶总黄酮可降低糖尿病及心血管系统疾病发生的危险。血清脂质过氧化反应可诱导炎症因子及炎症反应,本研究发现预防性给予桑叶总黄酮能显著降低高脂诱导的大鼠