缺氧-复氧对大鼠心肌微血管内皮细胞中hif-1、nhe1表达及nhe1活性的影响

缺氧-复氧对大鼠心肌微血管内皮细胞中hif-1、nhe1表达及nhe1活性的影响

微血管内皮细胞（mvecs）是心肌组织与血液氧气交换的主要障碍，在心肌缺血缺氧中发挥着重要作用。随缺血缺氧的加重,细胞由原来有氧代谢向乏氧代谢转变,细胞内酸中毒,pH值下降,细胞生存必定存在代偿机制。钠氢交换体-1(sodium/hydrogenexchanger-1,NHE1)是调节细胞内pH值的重要细胞膜蛋白分子,其编码基因的启动子中存在核因子缺氧诱导因子-1(hypoxia-induciblefactor-1,HIF-1)结合的位点,而HIF-1在缺氧时因降解减少而聚集,故推测在缺氧时,NHE1表达可能升高,参与细胞内pH的调节。本研究观察缺氧-复氧后原代培养的大鼠心肌微血管内皮(ratmyocardialMVECs,RMMVECs)HIF-1、NHE1的表达改变及NHE1活性变化,探讨NHE1在缺氧中对细胞内pH的调节的代偿机制。1材料和方法1.1免疫细胞化学法检测bmSD大鼠购自重庆医科大学实验动物中心,4周龄,雌雄不限,体质量100～120g。原代培养参照文献方法稍有改动后进行。剪取左心室壁,剪成1mm×1mm×1mm小块,0.2%(质量体积比)的胶原酶Ⅱ型溶液(Sigma公司)及2%(质量体积比)胰蛋白酶相续消化各15min,含20%胎牛血清的DMEM培养基静置孵育,待细胞生长至近汇合状态时进行传代培养。免疫细胞化学法检测细胞Ⅷ因子相关抗原进行细胞鉴定。一抗用兔抗大鼠Ⅷ因子相关抗原抗体(SantaCruz公司),二抗用生物素化山羊抗兔IgG(武汉博士德公司生产),SABC试剂作用后DAB(武汉博士德公司)显色,显微镜下摄像。1.2氧合酶原激活剂nhe1实验分为缺氧与复氧两部分。将RMMVECs置于1%O2缺氧培养箱中培养,或将在含氯化钴培养基(终浓度100μmol/L)培养细胞置于21%O2常氧培养(化学模拟缺氧)。检测基因表达分为缺氧0、12、24h3组,检测细胞NHE1活性分为无Na+对照组,缺氧0、12、24h及缺氧0h+DMA、12h+DMA、24h+DMA组共7组。将缺氧培养24h细胞再给予21%O2常氧培养0、24、48h。检测蛋白表达分为复氧0、24、48h3组,检测细胞NHE1活性分为无Na+对照组,复氧0、24、48h及复氧0h+DMA、24h+DMA、48h+DMA共7组。1.3-actin单克隆抗体nhe1的表达收集各组细胞提取蛋白,SDS胶电泳分离蛋白,转移至PVDF膜(Millipore),封闭后加入一抗(HIF-1α多克隆抗体1∶200,碧云天;NHE1多克隆抗体1∶200,SantaCruz;β-actin单克隆抗体1∶2500SantaCruz),次日加入1∶300稀释HRP标记的二抗(山羊抗兔Ig,1∶300,博奥森),ECL检测,X线片记录。经软件QuantityOne分析系统处理,分别以HIF-1α、NHE1与β-actin灰度比值表示HIF-1α、NHE1表达的相对含量。4次独立实验结果进行统计学分析。1.4ctcg治理提取各组细胞总RNA,反转录产物做PCR。PCR引物序列及产物:NHE1上游5′-TGGGCGGCGAGCAGATCAAT-3′,下游5′-CTCCACGTAGGGGCGCATCA-3′,产物464bp;β-actin上游5′-GACAACGGCTCCGGCATGTG-3′,下游5′-GGGCCACACGCAGCTCATTG-3′,产物262bp。PCR产物在2%琼脂糖进行电泳分析,图像处理系统检测条带的吸光度值,以NHE1与内参β-actin吸光度的比值(NHE1/β-actin)表示NHE1mRNA的相对含量。1.5细胞培养和回复率检测荧光强度比值(fluorescenceintensityratio,FIR)测定按BCECF/AM法进行。取缺氧或复氧不同时间的细胞,重悬于预冲N2处理的低氧细胞灌洗缓冲液(Cellperfusionbuffer,CPB)或常氧CPB中,加入或不加入NHE1阻断剂二甲基阿米洛利(DMA)(终浓度100μmol/L,Invitrogen),37℃孵育30min;加入BCECF-AM(终浓度1μmol/L,Invitrogen),37℃孵育30min;用CPB漂洗后置于荧光分光光度计检测,激发波长为495nm和440nm,发射波长为530nm,计算两激发波长下发射波长荧光强度比FIR=D(495)/D(440)。检测酸负荷后细胞内pH值回复率,采用含20mmol/LNH4Cl的CPB缓冲盐溶液漂洗细胞3min,之后用CPB诱导NHE1依赖的细胞内pH值回复。上述实验以无Na+溶液(以等摩尔数N-甲基-D-葡萄胺代替CPB中NaCl)代替CPB作为细胞内pH值测定的对照。细胞内pH值校正曲线制作参照文献进行。细胞分别重悬于pH值6.5～8.0高钾溶液中,加入BCECF-AM(终浓度1μmol/L)、Nigericin(终浓度5μmol/L,Sigma)孵育30min,以pH值和对应FIR求出回归方程,作出细胞内pH值校正曲线。根据此曲线将检测FIR转换为相应的细胞内pH值。1.6数据统计分析数据用ˉx±sx¯±s表示,采用SPSS17.0统计软件,进行方差分析,两两比较方差齐时用LSD检验,方差不齐时用DunnettT3检验。2结果2.1生长状大形面原代培养微血管内皮细胞生长呈“铺路石状”,生长于盖玻片上细胞形态扁平,呈三角形、多边形无规则形。免疫细胞化学染色可见内皮细胞细胞质呈棕黄色,Ⅷ因子相关抗原呈阳性,细胞阳性率在95%以上(图1),提示原代培养获得较纯RMMVECs,可用于后续实验。2.2氯化铬化学模拟缺氧体he1表达HIF-1α蛋白在常氧下(缺氧0h)表达很低,缺氧12h明显增加,缺氧24h较0、12h均明显增加(P<0.01)。NHE1常氧(缺氧0h)下有表达,缺氧12h有增加,但增加的幅度较HIF-1要小,而24h时增加非常显著(P<0.01)。氯化钴化学模拟缺氧发现HIF-1α、NHE1均升高,而且HIF-1α及NHE1蛋白表达模式类似真实缺氧改变(P<0.01)。RT-PCR结果发现缺氧后mRNA表达在缺氧12h升高最明显,缺氧24h相对于缺氧0h(未缺氧)也明显升高(P<0.01),见图2。2.3不同给药时间对各病理细胞ph值的影响在细胞内pH值达到相对稳定状态,给予NH4Cl刺激后pH迅速升高,撤出NH4Cl置换为含Na+而不含HCO-3的CPB液,细胞转变为酸中毒状态并且pH缓慢回升,计算回复前5min的△pH/△T作为酸负荷后pH回复率。结果显示缺氧12h组的细胞内pH值较缺氧0h(未缺氧)组降低(P<0.01)而缺氧24h的细胞内pH值较12h进一步减低(P<0.05)(表1)。相对于缺氧0h组,缺氧12、24h组的pH回复率均减低(P<0.01)(表1)。给予NHE1特异抑制剂DMA100μmol/L干预,结果显示细胞内pH值均低于相应时间点未给予DMA干预的细胞内pH值(P<0.05)(表1);相对于DMA未处理组,不同时间点上,DMA处理组的酸负荷后pH回复率均降低,在缺氧0h组最明显,缺氧12h组次之,缺氧24h组抑制率最小(P<0.01)(表1)。2.4复氧对细胞内ph值的影响相对于复氧0h(即缺氧24h),复氧24、48hHIF-1α蛋白表达显著下降,几乎恢复到缺氧前水平,而NHE1在24、48h分别下降31.93%、68.30%(图3)。检测细胞内pH值显示,复氧24、48h细胞内pH值恢复甚至超过缺氧前水平;给予DMA干预后,各时间点胞内pH值均下降(P<0.01)(表2)。复氧24h酸负荷后细胞内pH值回复率最高(0.119U/min),其次为48h的细胞内pH值回复率(0.089U/min),最小为复氧0h的细胞内pH值回复率(0.045U/min);DMA降低酸负荷后细胞内pH值回复率,以24h抑制幅度最明显,48h次之,0h最小(P<0.01)(表2)。3缺氧条件下nhe1蛋白及活性变化心肌缺血缺氧时,糖酵解加强,乳酸及H+增加,细胞生存需将过多的H+泵出细胞外。HIF-1是缺氧诱导的重要核转录因子,可转录调控众多基因的表达。NHE1是细胞内pH值的重要调节者,表达活化的NHE1可以促进缺血再灌注的心肌保护,增强脂肪酸氧化、糖酵解效率,增加ATP产生。本实验也观察到HIF-1α在常氧下及复氧后的蛋白表达量很低,缺氧明显增加,可能是常氧状态下HIF-1α很快经泛素蛋白酶体途径降解,缺氧时降解被抑制。在缺氧条件下,HIF-1及NHE1均升高,而且被氯化钴化学模拟缺氧所证实。RMMVECs中的研究结果与肺血管平滑肌细胞中HIF-1过表达导致NHE1蛋白及mRNA水平升高相一致。提示缺氧时升高的HIF-1可能与NHE1的启动子区域存在HIF-1结合的缺氧诱导反应元件相结合,促进NHE1的转录,进而导致蛋白水平升高。NHE1半衰期长,更新速度较慢,而且NHE1的降解与泛素化酶系统活性相关,可能在缺氧影响NHE1降解速度,终导致NHE1蛋白水平升高。本实验还发现在1%O2缺氧12、24h,细胞NHE1的活性不是升高,反而呈现降低,表现在胞内pH值下降,酸负荷实验显示pH恢复时间延长,ΔpH/ΔT下降,进而对NHE1阻断剂DMA反应减弱。NHE1活性降低,细胞内pH降低的研究结果,与Shimoda等研究发现细胞内pH升高不一致,可能是本实验采用的1%O2严重缺氧模型,细胞酸性产物明显增加,产生H+速度超过NHE1排出H+速度。提示在缺氧情况下,HIF-1诱导NHE1蛋白水平升高是细胞内pH调节的重要的代偿机制,但是这种代偿机制是有限的,过长时间重度缺氧会导致升高的NHE1蛋白分子功能被抑制。另外,复氧24h对NHE1阻断剂的反应较缺氧前、缺氧期间以及缺氧后48h均显著,而复氧48h后较复氧24h对NHE1阻断剂的反应减弱。在复氧后细胞pH改变及酸负荷后ΔpH/ΔT对NHE1阻断剂反应程度,与NHE1表达水平相对应,可能解释是在复氧情况下NHE1活性开始恢复,胞内抑制NHE1活性各种因素在减弱。本研究旨在探讨RMMVECs中NHE1的表达及活性改变,故选择的缺氧及复氧时间点上,尚不能完全反映NHE1活性的改变,但可显示NHE1表达与活性相分离的现象。提示急性心肌梗死时尽早开通闭塞血管,减少缺氧及HIF-1诱导NHE1表达与活性改变对心肌各组织细胞功能的不良影响至关重要。缺氧过重持续时间过长,NHE1活性受抑制,对NHE1抑制剂反应减弱,提示及时运用NHE1抑制剂可能对缺血心肌组织细胞才具有保护作用,在一定程度上能解释NHE1特异抑制剂在心肌保护的动物实验以及冠脉旁路手术运用的临