狗牙根改善胰岛素抵抗活性部位的筛选 中药学专业

前言糖尿病为当前威胁人类健康的非传染性疾病（noncommunicablediseases,NCD）之一，近年来，全球糖尿病发病率呈逐年增高趋势。截至2015年，中国糖尿病患者已超过1亿，位于世界首位，预计到2040我国糖尿病患者人数将增至超过1.5亿人REF_Ref18778\r\h[1]。糖尿病发展到一定阶段时，会出现各种并发症如糖尿病足，高血症，中风，糖尿病脑病等，严重影响患者的生活质量。2型糖尿病（type2disabetesmellitus,T2DM）是糖尿病的主要发病类型，约占该疾病的90%，系临床常见的慢性内分泌系统疾病。据统计调查，T2DM发病年龄越来越低龄化REF_Toc12780\r\h[2]，该问题为全人类社会带来严峻挑战，寻找有效药物治疗并预防2型糖尿病一直是各学者的研究热点。T2DM的发病机制主要为胰岛素抵抗（insulinresistance,IR）、β细胞分泌缺陷两方面，而胰岛素抵抗不仅是T2DM的始动因素，并且贯穿于T2DM发生的全过程REF_Toc31795\r\h[3]。研究发现，T2DM患者中有约90%的患者存在IR，但目前对具体发病机制尚未阐明REF_Toc21527\r\h[4]。IR又称胰岛素敏感性下降，是指胰岛素介导下的葡萄糖利用率降低的一个现象。因此，增强胰岛素的敏感性、改善胰岛素抵抗对于防治2型糖尿病具有重要意义。基于在人体内进行相关试验研究存在着难度大、时间长、差异大等诸多问题，开展体外细胞试验具有极其重要的意义REF_Ref30357\r\h[5]。体外建立细胞模型，模拟胰岛素抵抗，是利用不同药物直接作用各组织细胞，使各组织细胞对胰岛素敏感性降低，细胞在相同浓度胰岛素刺激下葡萄糖的吸收量减少，产生胰岛素抵抗。这种细胞模型复制周期较短、易于重复、影响因素易于控制，可以直观、快捷的研究胰岛素抵抗的发生机制，为筛选潜在改善胰岛素抵抗作用的药物提供方便。胰岛素作用的靶器官主要有肝脏、脂肪和骨骼肌，目前体外研究胰岛素抵抗的细胞模型与方法较多，但大多集中在这三种组织，主要有人正常肝细胞（L02）及肝癌细胞（HepG2）、骨骼肌细胞（L6）、小鼠脂肪细胞（3T3-L1）等REF_Toc21550\r\h[6]。由于肝脏是人体内物质代谢的中心，葡萄糖的摄取、储存、合成及代谢主要在这里发生，其对于维持血糖稳定具有直接而重要的作用，并且肝脏是人体胰岛素受体最密集的器官之一，故肝脏代谢的紊乱对于IR的发生具有重要的意义REF_Toc30934\r\h[7]。目前使用的肝细胞模型大多是人肝癌细胞HepG2，该细胞系一种源于人的肝胚胎瘤细胞，且表型与人正常肝细胞极为相似。其保留有正常肝细胞的基本生物特征，利于体外培养，又没有正常肝细胞所具有的易衰亡现象。在高浓度胰岛素作用下，HepG2细胞表面胰岛素受体数目下降，且下降程度与胰岛素浓度及作用时间呈正相关。因此，HepG2细胞是研究IR发病机制和降糖物质作用机制的理想细胞[8,9]。胰岛素是通过其相对应的信号转导途径来调控相关基因的表达，进而使代谢反应有序进行，因此，胰岛素信号通路任何地方发生功能障碍，均有可能引起IR。由于胰岛素传递信号十分复杂，为了能更清楚地阐明IR产生的机理，学者们进行了大量的体外研究，其中的主要手段就是采用细胞胰岛素抵抗模型，目前大多数研究采用高浓度胰岛素、高浓度葡萄糖、地塞米松、肿瘤坏死因子、游离脂肪酸等诱导IR细胞模型REF_Toc16463\r\h[10]。其中以高浓度胰岛素和地塞米松作诱导剂的偏多。目前西医上改善糖尿病胰岛抵抗的药物有双胍类、噻唑烷二酮类、磺脲类及-葡萄糖苷酶抑制等，但随着时间的推移，这些药物潜在的副作用逐渐显示出来，比如水肿、心脏衰竭、肝肾毒性等，这些使得这些药物的临床应用受到限制，而中药治疗具有药材来源丰富、价格便宜、副作用小、作用温和、持久、多靶点整体性治疗等优势，从而越来越受到各类学者的关注。大量的研究数据表明，中药在防治改善胰岛素抵抗方面发挥了重要作用，目前发现有改善胰岛素抵抗作用的单味中药达70余种，常用的有20余种。实验研究表明，这些中药的有效成分及其提取物主要有黄酮类、生物碱类、皂苷类、多糖类、挥发油、多酚类等。其中黄酮类主要为银杏叶总黄酮，黄芩总黄酮，山楂叶总黄酮，葛根素等；生物碱类主要为小檗碱，梓醇等；皂苷类主要有人参皂苷，三七总皂苷，西洋参总皂苷，白芍总苷，吉祥草总皂苷等；多糖类主要为枸杞多糖，黄芪多糖等；挥发油主要为鱼腥草挥发油；多酚类主要为白藜芦醇；其他的有余甘子提取物REF_Toc1066\r\h[11]。狗牙根，原名铁线草，系禾本科植物狗牙根Cynodondactylon（L.）Pars的全草，始载于《滇南本草》REF_Toc17578\r\h[12]；其分布广泛，在我国的分布以黄河流域以南各省为主，其次在西南、西北、华中、华南及华北南部也有分布，是我国分布最广、生态类型最多的野生暖季型草坪草REF_Ref30840\r\h[13]。据载，其味略苦微甘,性平，主入肝经，并入肺、肾经；具有祛风活络、解热、止血、生肌之效；主治头风痛目眩、风湿关节痹痛、拘劳伤吐血、跌打损伤、刀伤、臃疮、风痰疡软、筋骨疲痛等症REF_Toc5936\r\h[14]，研究表明其有降糖、抗菌、利尿等药理作用。目前，国内外学者开始对狗牙根在降血糖方面进行了药理研究。SaeidNafisi等REF_Toc13642\r\h[15]通过研究氯胺酮和赛拉嗪诱导持续并发的糖尿病小鼠模型，发现狗牙根是治疗糖尿病患者的良好替代药物。KarthikD.等[16,17]实验表明狗牙根水提物可以有效缓解高血糖和高血脂疾病，并且还能防止冠状动脉心脏病并发。KarthikD.等REF_Toc8030\r\h[18]的大鼠高血糖实验，说明狗牙根乙醇提取物能对糖尿病有治疗作用，可减少高血糖、高脂血症的风险。E.EJarald等REF_Toc11422\r\h[19]从狗牙根水提物中分离出芹菜素、木犀草等4种黄酮类成分，结果发现4种黄酮类成分与钠-葡萄糖协同转运蛋白-2（SGLT2）靶点结合效果与达格列净相似，该项研究为研究SGLT2抑制剂治疗糖尿病神经病变提供依据REF_Toc29408\r\h[20]。E.EJarald等REF_Toc11422\r\h[19]以四氧嘧啶诱导造模，通过比较狗牙根石油醚、氯仿、丙酮、乙醇、水部位的降血糖活性，结果发现狗牙根中水提取物的非多糖组分比水提取物活性更高。KhajaviRadA等REF_Toc22729\r\h[21]通过皮下注射甲苯磺丁脲诱导家兔暂时性高血糖模型，灌胃给药一小时后测血糖水平，发现与对照组相比，狗牙根组能显著降低血糖。SinghSK等[22-24]实验表明狗牙根水提取物和乙醇提取物均具有较好的降血糖和降血脂作用，但具体的降糖活性物质还未确定。IR作为T2DM的发病基础之一，一直是医药界的研究热点。根据现代药理药效研究，狗牙根提取物具有较好的降血糖作用，但是对于狗牙根中具体的降糖活性物质尚未明确，本课题拟采用高浓度胰岛素诱导HepG2细胞建立IR模型，对狗牙根各萃取部位促进胰岛素抵抗细胞糖吸收的活性进行筛选，为后期狗牙根降血糖活性物质的基础研究提供参考，也为开发新型的胰岛素增敏剂提供思路。2材料与仪器2.1实验细胞HepG2细胞购自中科院上海细胞所。2.2药品与试剂狗牙根药材购买于安徽亳州中药材市场，经广东药科大学中药学院陈磊副教授鉴定，确认其为禾本科植物狗牙根Cynodondactylon（L.）Pars的干燥全草；新生牛血清（NBCS），杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM高糖培养基，美国HyClone公司；青霉素/链霉素原液和胰蛋白酶，中国医学科院生物医学工程研究所；胰岛素，Sigma；葡萄糖测试盒，南京建成生物工程研究所；磷酸缓冲盐（PBS），天津市大茂化学试剂厂；WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（KGA316），江苏凯基生物技术股份有限公司；二甲基亚砜（DMSO），Amresco公司；96孔细胞培养板，美国NEST公司；实验所配试剂用水均为双蒸水；无水乙醇购自天津市致远化学试剂有限公司。2.3主要仪器SERIES8000WJ型二氧化碳细胞培养箱（ThernoScientific）；SW-CJ-1F型超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术）；CDX41型倒置相差显微镜（奥林巴斯（中国）有限公司上海分公司）；MJ-78A型全自动高压蒸汽灭菌器（广州飞迪生物科技有限公司）；DK-S22型数显恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；DW-HW328型-80℃超低温冰箱（中科美菱）；DHG-9077A型电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；S125D型十万分之一分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；ELX800型全自动酶标仪（BicTekInstruments）；TDL-80-2B型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；TG16MW2-16KL型低温高速离心机（Sigma）；FD-1C-50型冷冻干燥器（北京博医康实验仪器有限公司）；BCD-216SMK型低温冰箱（合肥美的荣事达电冰箱有限公司）；WP-UP-WF-10型微量分析型超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）。2.4试剂配制（1）HepG2细胞完全培养液：每100ml完全培养液中含有10ml新鲜牛血清（NBCS）和1ml双抗溶液，其余为DMEM高糖培养基。（2）终止液：由10%NBCS加DMEM高糖培养液组成。（3）PBS缓冲溶液：取一包PBS混合干粉溶解于2L双蒸水中，待完全溶解后，分装于蓝盖瓶中，高压蒸汽灭菌后放冷至室温，密封放入4℃冰箱保存备用。（4）WST-1溶液：将新购置的5ml装WST-1溶液先于超净工作台中分装于1.5mlEP管中，1ml/管，用锡箔纸包好后于-20℃保存备用；每次临用前将WST-1溶液与DMEM高糖培养基以1:10（v:v）比例混匀后使用。（5）胰岛素（Insulin）母液制备：精密称取适量胰岛素干粉（比如4mg），加入1ml冰醋酸使其完全溶解，加NaOH调PH至中性（7.2~7.6），再用双蒸水定容至10ml，浓度为6.89×10-5mol/L，除菌，分装，-20℃保存。（6）狗牙根总提取物及各萃取物的制备：狗牙根的干燥全草（20kg），用95%乙醇加热回流提取3次，合并提取液并减压浓缩浸膏。浸膏用蒸馏水溶解分散，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇三种不同极性的溶剂萃取3次，减压回收溶剂，得石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，水四个不同极性的部分。分别取总提取物及四个不同极性部位浸膏适量，然后用真空冷冻干燥器干燥后将各部分密封好于-20℃保存备用。3实验方法3.1HepG2细胞体外常规培养3.1.1细胞复苏将取出的冻存管迅速置于37℃水浴中，并不时摇动，直到管中只剩下最后一片结晶，用75%酒精消毒后，在超净台中将含有HepG2细胞的冻存液缓慢加入预先加好3ml完全培养液的无菌离心管中，边加边摇匀，用移液枪吹打使细胞均匀悬浮。在1000rpm，室温条件下离心3min，弃去上清液，再加入2ml完全培养液，吹打均匀，分别转移至2个T25培养瓶，1ml/瓶，并每瓶补4ml完全培养液，而后置于37℃、5%CO2培养箱中培养，次日更换培养液后继续培养。3.1.2换液当培养液色黄时，应进行换液。具体操作：弃去瓶中旧的培养液，加入2mlPBS洗去残留的细胞代谢物及细胞碎片，洗2次，弃去PBS，再加入5ml的完全培养液，后置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。根据细胞的生长情况，培养1或2日换液。3.1.3细胞传代当细胞生长至铺满瓶底80%以上时，需进行传代培养。具体方法为：弃去瓶中旧的培养液，并用PBS洗2次，每次2ml，之后加入0.25%胰蛋白酶消化液1ml，置于培养箱中消化约2min，将培养瓶放在倒置显微镜下观察细胞形态，当看到大多数细胞几乎缩成圆形，细胞间隙增大时，迅速加入含10%新鲜牛血清（NBS）的DMEM高糖培养液2ml终止消化（于超净工作台上操作），温和地反复吹打瓶壁，使细胞脱壁落掉，动作轻柔，以免产生过多的气泡，之后将混匀的细胞悬液转入备好的无菌离心管中，在1000rpm下室温离心3min。取出后弃去上清液，加2ml完全培养液，轻轻吹打使细胞均匀分布于培养液中，然后接种到新的培养瓶中，一般接种2-3个培养瓶，补足培养液，放入37℃、5%CO2培养箱中培养。3.1.4细胞冻存细胞的消化操作同传代，选取对数生长期的细胞，24h前更换新鲜培养液，离心后弃去上清液，加入9份完全培养液和1份DMSO配成的冻存液制成细胞悬液，计数，令细胞密度达1~5×106个/ml，之后将细胞悬液分装于冻存管中，1ml/管，标上实验员姓名、日期、细胞名称及代数后将冻存管置于程序降温盒内，放入-80℃冰箱中，次日转入液氮罐中。3.2HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立3.2.1实验分组（1）空白组：除了不加细胞，其余同对照组（2）对照组：正常培养的HepG2细胞（3）模型组：给予含有不同浓度胰岛素110-11、1×10-10、1×10-9、110-8、110-7、110-6、110-5mol/L的培养液3.2.2WST-1法检测各组细胞存活率取对数生长期细胞消化后，加入适量正常培养液制成细胞混悬液，将细胞以104个/孔接种于96孔板中继续培养，每块板分为空白组、对照组和模型组，每组6个复孔。待细胞单层贴壁后，空白组和对照组加入正常培养液，模型药组分别加入事先配制好的含有不同浓度胰岛素的培养液，分别培育12h、24h、36h。作用时间完成后，弃去上清液，每孔加入110l稀释好的WST-1液体，加好后放入培养箱继续培育4h后用酶标仪于450nm检测，得到各孔的吸光度值（OD值），之后计算出各组细胞的存活率REF_Ref8843\r\h[25]。计算公式如下:（实验组OD值-空白组OD值）细胞存活率%=×100（公式1）（对照组OD值-空白组OD值）细胞存活率越接近100%，说明胰岛素作用浓度或作用时间对细胞活性影响越小。3.2.3胰岛素对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响参考文献方法并略作改进[26,27]。将处于对数生长期的细胞消化后接种于96孔板中，每块板分为空白组、对照组和模型组，对照组和不同浓度模型组加入细胞104个/孔，每孔100l，空白组加入培养液100l/孔。培育24h后，弃去旧培养液，PBS洗涤2次，空白组和对照组加入正常培养液，模型组分别加入新配置好的含有浓度胰岛素110-11、1×10-10、1×10-9、110-8、110-7、110-6mol/L的培养液，分别培育12h，24h，36h。作用时间完成后，收集各组细胞上清液，经离心后取上清液用葡萄糖测定试剂盒检测其中的葡萄糖含量。检测波长为570nm，以无细胞的空白组为空白对照，计算各组细胞的葡萄糖消耗量（Glucoseconsumption，GC）。此外，在取过上清液的96孔板各孔中均加入稀释好的110lWST-1溶液，继续培育4h后于450nm检测吸光度值。为了考虑细胞增殖的影响，最后以GC/OD表示各组细胞葡萄糖消耗情况，以消除细胞数量差异带来的影响REF_Toc13512\r\h[28]，通过这个方法优化胰岛素浓度和时间以建立适宜的高浓度胰岛素诱发的HepG2细胞IR模型。该部分中涉及到的计算公式如下：各孔葡萄糖浓度（mmol/L）=标准品浓度×（样品孔OD-空白孔OD）/（标准孔OD-空白孔OD）（公式2）GC（mmol/L）=空白组葡萄糖浓度-各组葡萄糖浓度（公式3）由上面方法选择胰岛素最佳作用浓度及胰岛素最佳作用时间，建立由胰岛素诱发的HepG2细胞胰岛素抵抗模型。3.3WST-1法检测狗牙根各萃取部位对HepG2细胞增殖活性的影响3.3.1实验分组（1）空白组：除了不加细胞，其余同对照组（2）对照组：正常培养的HepG2细胞（3）给药组：给予含有药物1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100g/ml的培养液3.3.2实验步骤取对数生长期细胞消化后，加入适量正常培养液制成细胞混悬液，将细胞以104个/孔接种于96孔板中继续培养，每块板分为空白组、对照组和给药组。培养24h，弃去旧培养液，空白组和正常对照组加入正常培养液，不同浓度给药组分别加入事先配制好的含有药物1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100g/ml的培养液。药物刺激24h后，用WST-1细胞活性检测试剂盒检测细胞的生长情况，结果用细胞存活率表示，以此评价药物对正常HepG2细胞增殖活性的影响。细胞存活率计算公式同公式1。3.4狗牙根各萃取部位对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗的影响3.4.1实验分组（1）空白组：除了不加细胞，其余同对照组（2）对照组：正常培养的HepG2细胞，不加受试药物和造模剂（3）模型组：不加受试药物预处理，给予含有1×10-7mol/L胰岛素的培养液（4）药物处理组：先给予含有浓度1.5625、3.125、6.25、12.5g/ml药物的培养液，再加造模剂造模3.4.2实验步骤将处于对数生长期的细胞消化后，加入适量正常培养液制成细胞混悬液，正常对照组、模型组和药物处理组按104个/孔，每孔100l接种至96孔板中，空白组加入正常培养液100l/孔。培养24h后，弃去培养基，空白组、正常对照组和模型组加入正常培养液，药物预处理组分别加入事先配制好的含有药物1.5625、3.125、6.25、12.5g/ml的培养液。预干预24h后，弃去细胞上清液，PBS洗涤2次后，空白组和对照组加入正常培养液，模型组和药物处理组加入新配置好的含有1×10-7mol/L胰岛素的培养液，培育24h。作用时间完成后，收集各组细胞上清液，经离心后取上清液用葡萄糖测定试剂盒检测其中的葡萄糖含量。检测波长为570nm，以无细胞的空白组为空白对照，计算各组细胞的葡萄糖消耗量（GC）。此外，在取过上清液的96孔板各孔中均加入稀释好的110lWST-1溶液，继续培育4h后于450nm检测吸光度值。最后以GC/OD表示各组细胞葡萄糖消耗情况。计算方法同3.2.3。3.5统计分析采用SPSS21.0软件进行统计分析。两组间计量资料比较采用独立样本t检验，三组及三组以上间比较采用单因素ANOVA方差分析的方法，当P<0.05表示差异具有显著性，P<0.01表示差异具有极显著性，两种均具有统计学意义。4结果4.1胰岛素对HepG2细胞增值的影响由表1可知，在不同胰岛素浓度（1×10-11、1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L）分别作用HepG2细胞12h,24h,36h后，1×10-11~1×10-6mol/L浓度下的胰岛素作用细胞的存活率与对照组相比，无显著性差异（P>0.05）,说明对细胞增值无抑制作用。当胰岛素浓度为1×10-5mol/L时，表现出明显的细胞抑制作用（P<0.05或P<0.01），且随着作用时间的增长，对细胞的增值抑制越大。故说明1×10-5mol/L的胰岛素不适宜用来建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型。4.2胰岛素对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响与对照组比较，若单位细胞消耗葡萄糖量减少（GC/OD值降低），则说明产生胰岛素抵抗。通过表2可知，比对对照组，1×10-8mol/L胰岛素作用24h，1×10-7mol/L胰岛素作用24h、36h，1×10-6mol/L胰岛素作用24h后均能显著降低细胞对葡萄糖的消耗（P<0.05），但1×10-7mol/L胰岛素在作用24h后对葡萄糖的消耗降低最明显（P<0.01）；此外，1×10-9mol/L胰岛素作用36h及1×10-6mol/L胰岛素作用12h却能显著增加细胞对葡萄糖的消耗（P<0.05）；其余各组细胞对葡萄糖消耗有一定的变化，但均无统计学意义。综上，故确定1×10-7mol/L胰岛素作用24h为本实验的HepG2细胞胰岛素抵抗模型最佳造模条件。此造模条件与一些学者的HepG2细胞胰岛素抵抗模型造模数据有差别，可能与细胞的来源，实验条件及实验方法有关。表1不同胰岛素浓度作用不同时间对HepG2细胞存活率的影响（n=6）/100%胰岛素浓度（mol/L）作用时间/h122436对照组（0）100.0±3.9100.0±15.4100.2±24.610-1199.8±3.7103.3±12.2112.2±2.310-10107.6±2.7103.1±11.7114.5±22.510-9107.5±3.999.1±12.1111.5±18.210-8109.4±2.7100.1±12.6116.4±16.410-7108.2±4.1101.2±15.0112.0±21.110-698.7±2.8105.3±10.9115.2±8.910-574.4±1.5*36.6±6.7**31.3±3.8**注：与对照组比较，*表示差异显著（P<0.05）,**表示差异极其显著（P<0.01）。下同。表2不同胰岛素浓度作用不同时间对HepG2细胞糖消耗的影响（n=6）GC/OD胰岛素浓度（mol/L）作用时间/h122436对照组（0）1.224±0.2462.207±0.3442.396±0.18710-111.091±0.4162.156±0.4582.248±0.25610-101.630±0.2002.017±0.0862.638±0.35210-91.131±0.5362.169±0.2402.740±0.133*10-81.141±0.3841.727±0.162*2.483±0.23110-71.250±0.2121.486±0.436**1.947±0.059*10-61.826±0.430*1.702±0.520*2.143±0.2514.3狗牙根各萃取部位对正常HepG2细胞增殖活性的影响如表3-1~表3-5所示，加狗牙根不同浓度各萃取部位刺激细胞24h后，与对照组比较，总提取物在25、50、100ug/ml浓度组及水部位在100ug/ml浓度组下均能显著提高细胞的存活率（p<0.01）；而乙酸乙酯部位在25、50、100ug/ml浓度组下对细胞产生明显的抑制作用（p<0.01），且随浓度增加，抑制越明显，在100μg/ml浓度时，细胞存活率只有43.9%；石油醚部位和正丁醇部位各浓度组对细胞存活率无显著影响（p>0.05）。综上，确定各萃取物的给药浓度为1.5625、3.125、6.25、12.5g/ml。4.4狗牙根各萃取部位对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗的影响如表4-1~表4-5所示，与对照组比较，模型组细胞葡萄糖消耗明显下降（P<0.01），即产生胰岛抵抗；与模型组比较，狗牙根总提取物在12.5g/ml浓度组明显增加细胞葡萄糖消耗（P<0.05），其余浓度组对细胞葡萄糖消耗无明显影响，另外在本实验浓度范围内，细胞葡萄糖的消耗量随着狗牙根总提取物浓度的增大逐渐增加，提示一定的剂量依赖性；石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位在本实验给药浓度范围内均显著增加细胞葡萄糖的消耗（P<0.01），其中乙酸乙酯部位对细胞葡萄糖的消耗量随着浓度的增加而增加，呈现剂量依赖性，在12.5g/ml时最大，增加的细胞葡萄糖消耗率达57.6%，正丁醇部位对细胞葡萄糖消耗的影响在1.5625~12.5g/ml范围内呈现一个先升高后降低的趋势，在3.125g/ml时增加细胞葡萄糖的消耗率最大，达37.8%；石油醚部位对葡萄糖的消耗随浓度的变化不大；水部位在1.5625、6.25g/ml浓度组能明显改善细胞葡萄糖消耗（P<0.05，或P<0.01），但在12.5g/mL浓度时降低细胞葡萄糖的消耗。综上，在本实验浓度范围内（1.5625、3.125、6.25、12.5g/ml）乙酸乙酯部位改善高胰岛素诱导的IR-HepG2细胞的活性相对最好，其次是正丁醇部位、石油醚部位，最后是水部位。表3-1狗牙根总提取物对HepG2细胞存活率的影响（n=6）组别给药浓度(μg/ml)存活率(%)对照组0100.0±6.51.562599.5±4.73.12596.8±4.2总提取物6.25101.8±5.212.5101.0±4.125110.1±4.0**50114.0±3.6**100117.3±4.2**注：n=6，与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，下同。表3-2狗牙根石油醚部位对HepG2细胞存活率的影响（n=6）组别给药浓度(μg/ml)存活率(%)对照组0100.0±2.01.562598.2±7.03.12598.3±4.5石油醚部位6.25100.1±2.412.5102.0±3.225102.6±2.450101.7±0.5100103.2±1.4表3-3狗牙根正丁醇部位对HepG2细胞存活率的影响（n=6）组别给药浓度(μg/ml)存活率(%)对照组0100.0±2.91.562598.6±3.43.12599.1±3.5正丁醇部位6.2596.4±9.612.597.9±8.02595.3±9.550101.5±6.4100104.1±11.8表3-4狗牙根乙酸乙酯部位对HepG2细胞存活率的影响（n=6）组别给药浓度(μg/ml)存活率(%)对照组0100.0±4.91.5625101.3±5.83.12599.9±2.5乙酸乙酯部位6.2599.3±2.212.594.6±2.32587.8±7.7**5074.2±4.5**10043.9±6.4**表3-5狗牙根水部位对HepG2细胞存活率的影响（n=6）组别给药浓度(μg/ml)存活率(%)对照组0100.0±4.71.562596.2±4.83.125100.9±7.6水部位6.25100.8±5.312.5103.6±3.425105.8±12.650104.9±6.7100115.9±5.1**表4-1狗牙根总提取物对IR-HepG2细胞糖消耗的影响（n=6）组别给药浓度(μg/ml)GC/ODGC/OD（%of对照组）对照组01.556±0.128100.0模型组01.202±0.071##77.3总提取物1.56251.247±0.06580.13.1251.251±0.064##80.46.251.356±0.190#87.112.51.398±0.140*89.8注：n=6，与对照组比较，#p<0.05，##p<0.01与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01，下同。表4-2狗牙根石油醚部位对IR-HepG2细胞糖消耗的影响（n=6）组别给药浓度(μg/ml)GC/ODGC/OD（%of对照组）对照组02.019±0.071100.0模型组01.575±0.064##78.0石油醚部位1.56252.050±0.147**101.53.1252.031±0.260**100.66.252.082±0.125**103.112.51.965±0.090**97.3表4-3狗牙根乙酸乙酯部位对IR-HepG2细胞糖消耗的影响（n=6）组别给药浓度(μg/ml)GC/ODGC/OD（%of对照组）对照组02.117±0.107100.0模型组01.518±0.097##71.7乙酸乙酯部位1.56251.986±0.094**93.83.1252.067±0.290**97.66.252.259±0.214**106.712.52.738±0.216**129.3表4-4狗牙根水部位对IR-HepG2细胞糖消耗的影响（n=6）组别给药浓度(μg/ml)GC/ODGC/OD（%of对照组）对照组03.609±0.069100.0模型组03.060±0.111##84.8水部位1.56253.302±0.199*91.53.1253.267±0.05090.56.253.462±0.056**95.912.52.838±0.104*78.6表4-5狗牙根正丁醇部位对IR-HepG2细胞糖消耗的影响（n=6）组别给药浓度(μg/ml)GC/ODGC/OD（%of对照组）对照组02.680±0.360100.0模型组02.190±0.359#81.7正丁醇部位1.56252.789±0.190**104.13.1253.203±0.212**119.56.252.855±0.291**106.512.52.932±0.409**109.45讨论应用疾病模型进行筛选实验是现代医学科学的一个重要研究手段，因此建立可靠的疾病模型对于药物筛选来说极其重要。本实验拟建立胰岛素抵抗的细胞模型来筛选药物的有效部位，选定合适的细胞来源是首要任务。肝脏是人体内物质代谢的中心，在糖代谢中起着非常重要的作用。并且肝脏是人体胰岛素受体最密集的器官之一,对胰岛素的促摄糖作用极为敏感。本实验选用来源于肝细胞、具有肝细胞生物特性的HepG2细胞经高胰岛素诱导使之成为胰岛素抵抗的细胞模型,在一定程度上模拟了胰岛素抵抗的自然发病过程。HepG2细胞表面的胰岛素受体数目受胰岛素水平和作用时间的调节，当胰岛素受体数目下调到一定程度时,则该细胞对胰岛素的作用产生抗性。本实验中，通过胰岛素体外诱导法确定HepG2细胞胰岛素抵抗的最佳作用时间及作用浓度，建立胰岛素抵抗模型。实验结果显示，不同浓度胰岛素刺激HepG2细胞，诱导IR时，1×10-7mol/L的胰岛素作用24h后细胞的葡萄糖消耗量最低，且细胞存活率也不受影响，故确立1×10-7mol/L的胰岛素浓度为胰岛素抵抗的最佳浓度，24h为胰岛素抵抗作用的最佳时间。该条件为本次实验的建模条件。用不同浓度的狗牙根各萃取部位作用于正常HepG2细胞以确定给药浓度，结果发现除了乙酸乙酯部位在25、50、100g/ml浓度时显著抑制细胞增殖，有一定的细胞毒作用之外，其余各不同浓度萃取部位对细胞均无明显的细胞毒作用，因此确定各萃取部位的给药浓度为1.5625、3.125、6.25、12.5g/ml。利用所建立的胰岛素抵抗模型对狗牙根各萃取部位的活性进行筛选，结果发现，乙酸乙酯部位、石油醚部位和正丁醇部位在实验给药浓度范围内均具有较好的活性，而相比之下，乙酸乙酯部位表现出较好的剂量依赖性，活性也更好一些；总提物在12.5g/ml时和水部位在1.5625、6.25g/ml时也表现出一定的活性，但是相对乙酸乙酯部位、石油醚部位和正丁醇部位而言其活性较差。6结论本实验选用1×10-7mol/L胰岛素作用24h建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型，并利用该模型对狗牙根各萃取部位进行活性筛选，实验结果发现狗牙根总提取物及各萃取部位对高胰岛素诱导的IR-HepG2模型均有一定的改善作用，其中乙酸乙酯部位的活性相对最好，其次是石油醚和正丁醇部位，总提取物和水部位的活性相对较差。参考文献AkramTKharroubi,HishamMDarwish.Diabetesmellitus:Theepi-demicofthecentury[J].WorldJournalofDiabetes,2015,6(6):850-857.汪会琴,胡如英,武海滨.2型糖尿病报告发病率研究进展[J].浙江预防医学,2016,28(1):37-57.陆菊明.胰岛素抵抗与2型糖尿病的发生关系[J].药物与临床,2014,11(23)：12-15.中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南(2013年版)[J].中国医学前沿杂志,2015,7(3):27.许乐,逄晓阳,芦晶,等.HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立及其应用[J].核农学报,2017,31(9):1775-1781.张世卿,佟丽.胰岛素抵抗作用发生机制及动物模型研究进展[J].中药新药与临床药理,2012,23(3):364-368.StaehrP.,Hother-NielsenO.,Beck-NielsenH..Theroleoftheliverintype2diabetes[J].Reviewsinendocrine&metabolicdisorders.2004,5:105-110.陈梦云,江国荣.胰岛素抵抗细胞模型研究进展[J].安徽医药,2012,16(6)；141-143.GumellM,SavageDB,ChatterjeeVK.Themetabolicsyndrome:Peroxisomeproliferator-activatedreceptorgammaanditstherapeuticmodulation[J].JournalofClinicalEndocrinology&Metabolism.2003,88(6):2412-2421.张泽生,李雨蒙,张梦娜,等.胰岛素抵抗细胞模型建立及药物评价的研究进展[J].中国食品添加剂,2016,10:198-203.赵轩,高彦彬.改善胰岛素抵抗的单味中药成分和作用机制研究[J].世界中医药,2013,8(7):840-843.国家中医药管理局《中华本草》.中华本草[M].上海:上海科学技术出版社，1999.张纯礼.草药铁线钱临床介绍[J].云南中医学院学报,1985(30).唐欣,向佐湘,苏鹏.狗牙根研究进展[J].作物研究,2009,05:383-386.NafisiS,NezhadyMAM,AsghariMH.ComparativeandMixtureEffectofCynodonDactylon,ElectroMagneticFieldandInsulinonDiabeticMouse[J].Balkanmedicaljournal,2012,29(4):345.KarthikD,RavikumarS.Characterizationofthebrainproteomeofratswithdiabetesmellitusthroughtwo-dimensionalelectrophoresisandmassspectrometry[J].Brainresearch,2011,1371:171-179.KarthikD,RavikumarS.ProteomeandphytochemicalanalysisofCynodondactylonleavesextractanditsbiologicalactivityindiabeticrats[J].Biomedicine&PreventiveNutrition,2011,1(1):49-56.KarthikD,RavikumarS.AstudyontheprotectiveeffectofCynodondactylonleavesextractindiabeticrats[J].BiomedicalandEnvironmentalSciences,2011,24(2):190-199.JaraldEE,JoshiSB,JainDC.AntidiabeticactivityofaqueousextractandnonpolysaccharidefractionofCynodondactylonPers[J].Indianjournalofexperimentalbiology,2008,46(9):660.AnnapurnaHV,ApoorvaB,RavichandranN,etal.IsolationandinsilicoevaluationofantidiabeticmoleculesofCynodondactylon(L.)[J].JournalofMolecularGraphicsandModelling,2013,39:87-97.KhajaviRadA,HadjzadehMAR,RajaeiZ,etal.ThebeneficialeffectofCynodondactylonfractionsonethyleneglycol-inducedkidneycalculiinrats[J].Urologyjournal,2011,8(3):179-184.SinghSK,RaiPK,MehtaS,etal.CurativeeffectofCynodondactylonagainstSTZinducedhepaticinjuryindiabeticrats[J].IndianJournalofClinicalBiochemistry,2009,24(4):410-413.SinghSK,RaiPK,JaiswalD,etal.Evidence-basedcriticalevaluationofglycemicpotentialofCynodondactylon[J].Evidence-BasedComplementaryandAlternativeMedicine,2008,5(4):415-420.SinghSK,KesariAN,GuptaRK,etal.AssessmentofantidiabeticpotentialofCynodondactylonextractinstreptozotocindiabeticrats[J].Journalofethnopharmacology,2007,114(2):174-179.顾爱彤,张卿,王峰.安息香保护内皮损伤的活性成分初步研究[J].广东化工,2017,44(14):11-12.姜保平,乐亮,许利嘉,等.HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立及在筛选两色金鸡菊活性化合物中的应用[J].中国现代中药,2017,19(2):165-173.方飞.桑叶有效部位改善HepG2胰岛素抵抗及其机制的研究[D].华南理工大学,2012.ZhengXK,YoonNY,BaeHJ,etal.AntigyperglycemicactivityofSelaginellatamariscina(Beauv.)Spring[J].JournalofEthnoparmacology.2011,133(2):531-537.综述中药抗2型糖尿病胰岛素抵抗的研究进展随着生活水平的提高，糖尿病的发病率逐年增加，已成为继肿瘤、心脑血管疾病之后严重危害人类健康的慢性疾病。临床上主要有1型糖尿病和2型糖尿病，其中2型糖尿病最为常见，占糖尿病人总数的90%以上，而且发病年龄越来越年轻化REF_Ref14919\r\h[1]。胰岛素抵抗（insulinresistance,IR）是指正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态，包括靶器官对胰岛素的敏感性降低和对胰岛素的反应性降低REF_Ref15559\r\h[2]。胰岛素抵抗不仅是2型糖尿病的发病基础，也是高血压、高血脂、冠心病等疾病的主要发病原因。虽然西药降血糖作用强、起效快，但往往缺乏整体的协调性，且具有明显的副作用，不利于糖尿病患者长期使用。近年来现代中药对糖尿病的研究有了进一步的深入，诸多研究表明中药治疗糖尿病多途径、多靶点、多环节，是综合治疗作用的体现。因此，从中药中寻找新的降血糖药物，对提高患者的整体状况有独特的优势REF_Ref15775\r\h[3]。本文就近年来各学者在研究中药治疗2型糖尿病胰岛素抵抗方面进行综述。1胰岛素抵抗的中医病机研究2型糖尿病属中医“消渴”范畴，病位重点在脾、肝、肾。为脾失健运，肝失疏泄，肾阳不化等脏腑功能失调所致。脾胃功能失调是IR发生的基础环节，肝失调达则肝糖原合成减少，肝糖原分解加速，肾阳不化，水湿内停是加重IR的重要环节；痰浊、瘀血产生IR还与高胰岛素血症、胰岛素拮抗激素的升高、血黏度增高有关，减弱胰岛素促进外周组织（肌肉、脂肪细胞）摄取和利用葡萄糖及抑制肝糖输出的效应而产生IRREF_Ref15807\r\h[4]。1.1IR与脾中医认为脾主运化、统血、输布精微，是水谷精微代谢的主要脏器。《素问·经脉别论篇》所述“饮入于胃，游溢精气，上输于脾。脾气散精，上归于肺，通调水道，下输膀胱。水精四布，五经并行”。《灵枢·本脏》记载：“脾脆则善病消瘅”；《素问·奇病论篇》记载：“此人必数食甘美而多肥也，转为消渴”。病理状态下，当各种致病因素影响到脾的运化功能时，脾失健运，不能将水谷精微“灌溉四旁”，其转输和散精功能减退，从而产生痰湿、浊瘀等病理产物，更重要的是水谷已转化的精微无法布散至肺、胃、肾，使其失去滋养而阴津不足由此产生多种病症REF_Ref15850\r\h[5]。痰湿内蕴可导致肥胖、高血糖、高血脂；痰湿内阻可致瘀，阻滞气机，可导致高血压；痰浊上泛，可导致中风；痰浊瘀血相互搏结，又可加重IR，脂糖代谢紊乱，变证丛生。江南等REF_Ref15889\r\h[6]认为2型糖尿病等代谢疾病的IR实质是脾气虚导致的痰湿内生，因阳虚及痰湿生瘀，因痰瘀滞留而生毒，部位重点在脾，和肝肾密切相关。1.2IR与肝中医认为肝主疏泄，调畅气机，且肝为刚脏，五行属木，喜条达而恶抑郁。肝失疏泄可致内分泌功能紊乱，《灵枢》曰：“肝脆则善病消瘅易伤。”肝气郁结、肝经实热、肝血瘀滞很可能是IR的致病因素之一REF_Ref15931\r\h[7]。饮食不节，过食肥甘，好逸恶劳，气血壅盛易致形体肥胖，痰湿内阻，郁遏肝气;长期的精神刺激，紧张压抑，易怒伤肝，肝失条达，气机紊乱;素体阴虚，劳欲过度，肾阴匮乏而致肝阴不足，肝失疏泄，致使气血津液等精微物质不能输布，积聚不化，湿浊内生，成痰成瘀，这些病理产物又会进一步影响肝之疏泄，继而引起脏腑功能紊乱，导致IR的产生发展REF_Ref15974\r\h[8]。有学者发现，肝脏很可能是体内胰岛素最大的调节器官，可影响人体对胰岛素的敏感性。王智明REF_Ref16016\r\h[9]等研究表明肝气郁结可作为2型糖尿病发病的始动因素，而诸多变证均是在气机郁滞基础上发生的。而近代研究也发现REF_Ref16088\r\h[10]，肝脏胰岛素抵抗在胰岛素抵抗研究中占据重要位置。1.3IR与肾中医认为肾藏精，主水，为先天之本。陈士铎《石室秘录》曰：“消渴之证，虽分上中下，而肾虚而致，则无不同也。”张景岳在《景岳全书·痰饮》中说：“五脏之病，虽皆能生痰，然无不由于脾肾。盖脾主湿，湿动则为痰；肾主水，水泛亦为痰”。肾气不足，会影响其他脏腑。如肾之阳气不足，会引起脾阳不足，影响水液代谢功能，从而产生痰湿、血瘀等病理产物，导致IR发生REF_Ref15807\r\h[4]。IR多发病于中年，可能与人到中年以后肾气不足有关。徐丽君等REF_Ref16140\r\h[11]认为，根据中医学理论，糖尿病以虚为本，虽然病变可累及肺、脾、肾等脏腑，但肾虚为病机的中心环节，其病理生理基础为IR。有学者认为脾肾同病的IR以健肾补脾泄浊法治疗疗效更好REF_Ref16193\r\h[12]。2中药对抗2型糖尿病胰岛素抵抗研究2.1单味中药中药在改善2型糖尿病胰岛素抵抗中的作用不容小觑：中医有记载能治疗消渴病的中药达70余种,其中临床上常用的有党参、人参、黄芪、生地黄、茯苓、薏苡仁、丹参、刺五加、白芍、生龙骨、生牡蛎、当归、知母、天花粉、大黄、鹿茸、苍术、白术、川芎、山药、麦冬、玉竹、天冬、五味子、山萸肉、地骨皮、僵蚕、甘草、仙灵脾、玄参等30余种REF_Ref16238\r\h[13]。单味中药一般都有一定的作用靶点改善IR，其作用机制主要体现在三方面:改善胰岛β细胞功能，刺激胰岛素分泌;增加胰岛素受体数目、增强胰岛素的敏感性;抑制胰岛素拮抗物质的分泌以及促进葡萄糖降解，最终达到改善IR的作用REF_Ref16278\r\h[14]。李宗友REF_Ref16313\r\h[15]观察胡芦巴乙醇提取物(4-羟基异亮氨酸)对大鼠胰腺的作用时发现，此化合物主要作用于β细胞血浆膜的K+通道，刺激胰岛素分泌。程秀珍等REF_Ref16369\r\h[16],用高热量饲料加小剂量链脲佐菌素建立实验性2型糖尿病大鼠模型后，用葛根、丹参、大黄治疗6周，测定空腹血糖、血脂、血清胰岛素，计算出胰岛素敏感指数，结果表明,葛根、大黄能降低实验性2型糖尿病大鼠空腹血糖、血脂，提高胰岛素敏感指数，改善IR。乔琳琳等REF_Ref16425\r\h[17]研究发现黄连煎剂可以明显改善IR，减少内脏脂肪，上调p-AMPK-α的蛋白表达明显优于黄连提取物盐酸小檗碱。郑琳颖等REF_Ref16467\r\h[18]发现白芍总苷能够拮抗大鼠的高胰岛素血症和IR，提高胰岛素的敏感性，降低血脂水平以及增强抗氧化能力。此外，朱荣强等REF_Ref16506\r\h[19]观察黄芪注射液改善60例2型糖尿病IR的作用，结果显示,黄芪注射液可以显著改善2型糖尿病IR。王钦茂等REF_Ref16555\r\h[20]研究提示丹皮多糖纯品2b可降低四氧嘧啶诱发的糖尿病小鼠模型的糖化血红蛋白水平，改善其口服葡萄糖耐量和IR，并认为其机制可能与促进外周组织对葡萄糖的利用，提高胰岛素的敏感性有关。何胜等REF_Ref16594\r\h[21]实验发现铁皮石槲对衰老糖尿病模型小鼠有明显的降血糖作用。李润生等REF_Ref16627\r\h[22]观察红景天制剂（诺迪康）对糖尿病肾病患者的治疗作用，患者血糖、尿蛋白、HbAlc和β2-MG均较治疗前明显下降，表明诺红景天糖尿病肾病具有很好的保护作用。刘颖等REF_Ref16676\r\h[23]采用正常血糖高胰岛素钳夹法评价不同剂量卷柏对IR大鼠模型胰岛素敏感性的影响，发现高剂量组胰岛素敏感性指标M值有明显改善,低剂量组能促进胰岛素的分泌，但无降低血糖作用，表明高剂量组卷柏对IR有明显改善。杜仲能显著提高糖尿病小鼠对胰岛素的敏感性且高剂量杜仲煎液的胰岛素增敏效应有可能优于罗格列酮REF_Ref16722\r\h[24]。吴迪炯等REF_Ref16829\r\h[25]采用高胰岛素诱导建立胰岛素抵抗的HepG2细胞模型的方法，探讨丹参对胰岛素敏感性的影响，发现含有丹参的胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖掺入率明显增高，说明丹参对细胞水平的胰岛素抵抗有一定的抑制作用。此外，人参含人参多糖、人参皂甙和齐墩果糖类,能兴奋中枢神经系统，加快神经冲动的传导，又能兴奋垂体—肾上腺皮质系统,增强肾上腺皮层功能，提高机体对外界不良条件刺激的抵抗力，因此能增强胰岛素的敏感性。黄芪含胆碱、叶酸、数种氨基酸等成分,能兴奋中枢神经系统，能增强网状内皮系统的吞噬功能,提高抗病能力,故可预防外源性所致胰岛素抵抗。地黄含梓醇地黄素、维生素A类物质、糖类及氨基酸，有轻微降血糖作用,能影响肝糖的代谢，使异常和紊乱的糖代谢向正常转化。白术含有挥发油，油中主要成分为苍术醇和苍术酮，并含维生素A类物质,有降血糖、保护肝脏、防止肝糖原减少的作用，增加机体对胰岛素的敏感性。麦冬含有甾体皂甙等物质，可直接刺激胰岛B细胞释放胰岛素，其作用类似磺脲类,能使胰岛细胞功能恢复正常。茯苓含茯苓聚糖、茯苓酸、蛋白质、脂肪、卵磷脂、组织胺、胆碱、麦角甾醇、钾盐、酵素、腺嘌呤等，有利尿、镇静、降血糖的作用,同时能改善胰岛素与胰岛素受体的结合率。枸杞子含胡萝卜素、维生素B1、B2、C、烟酸、钙、磷、铁、及B-谷甾醇、亚油酸等，能轻微抑制脂肪在肝细胞内沉淀和促进肝细胞新生的作用，能改善糖耐量，能提高肝糖原和肝葡萄糖酶活性，其改善胰岛素抵抗的机理与调节糖代谢酶活性有关REF_Ref16238\r\h[13]。2.2活性成分中药的有效成分及其提取物主要有黄酮类、生物碱类、皂苷类、多糖类、挥发油等。2.2.1黄酮类黄酮类主要分布在双子叶植物中，且大多数以苷的形式存在。银杏叶总黄酮具有扩张血管、降血脂、调节生物转化和基因代谢、调节内分泌等功能，唐嘉航REF_Ref16872\r\h[26]等实验证明其能有效调节IR大鼠血糖和血脂水平，增加胰岛素敏感性；山楂具有助消化、降血脂等功能，刘江REF_Ref16918\r\h[27]等实验证明山楂叶总黄酮对IR大鼠高血脂和氧化损伤起到了良好的防治作用，能够改善病鼠IR状态，增强其胰岛素敏感性，并具有良好的防治脂肪肝作用。2.2.2生物碱类生物碱是一类含氮的有机化合物，大多具有复杂的环状结构，是中草药的重要有效成分之一。Semwal等REF_Ref16957\r\h[28]从防己提取获得掌叶防己碱，并通过动物实验发现其能降低糖尿病小鼠的空腹血糖并能提高血清中胰岛素的含量，从而改善IR；从中药黄连提取得到的小檗碱在降血糖和改善胰岛素抵抗症状方面也有较多的研究报道，显示疗效确切、机制复杂REF_Ref17022\r\h[29]。罗春梅等REF_Ref17061\r\h[30]认为黄连的有效成分黄连素作用类似于二甲双胍，能有效促使肝糖原合成增加，通过葡萄糖的非氧化途径改善IR。2.2.3皂苷类苷是以苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，其具有广泛的药理活性，如解热、镇静、抗菌等。郭洁文等REF_Ref17104\r\h[31]系列研究表明：荔枝核提取物皂苷能改善实验性T2DM伴IR模型大鼠血糖、血脂、胰岛素、ISI、瘦素、TNF-α等指标，纠正相关脂肪细胞因子，改善糖脂代谢紊乱，增强胰岛素敏感性；胡芦巴皂苷可在不增加胰岛素分泌的情况下发挥降糖作用，其作用机理可能是其能增加2型糖尿病模型鼠对胰岛素的敏感性REF_Ref17146\r\h[32]。2.2.4多糖类多糖是一类至少由10个单糖分子通过苷键聚合而成的高分子碳水化合物，分为均一性多糖和不均一性多糖。研究表明，从中药里提取、分离获得的多糖类物质能降血糖和改善胰岛素抵抗症状的作用，不少学者还对其降糖机理作进一步深入的研究。麦冬的多糖含量能有效改善胰岛素敏感性，使周围组织对胰岛素的抵抗降低。黄芪多糖能够调节糖脂代谢，促进脂肪细胞分化，具有改善IR的作用，因此广泛运用于T2DM、肥胖和代谢综合征等代谢相关性疾病的防治。2.2.5挥发油类鱼腥草挥发油具有杀菌抗炎、调节机体免疫的作用，增加毛细血管韧性，降低毛细血管通透性，抑制炎性递质的释放，提高血清备解素水平，增强机体免疫能力，利尿降血脂，抑制血小板凝集作用等功效。王海颖等REF_Ref17205\r\h[33]进行了鱼腥草挥发油对糖尿病大鼠血脂和IR影响的研究。研究发现鱼腥草能够改善糖尿病肾损害，调节脂代谢，改善IR。2.2.6其他成分研究还发现一些多元醇(牛弥菜醇A)、含硫的小分子氨基酸(牛磺酸)、多肽类物质(苦瓜降糖多肽PA)、茶多酚、茶色素等在降血糖、改善胰岛素抵抗方面也有一定的效果REF_Ref17238\r\h[34]。2.3中药复方在中医治疗糖尿病IR的研究中，中成药治疗IR是不可或缺的环节，近年来，有关治疗T2DMIR的中成药不断涌现，且通过大量医学实验及临床观察证实疗效肯定REF_Ref17280\r\h[35]。王少蓉REF_Ref17319\r\h[36]临床观察津力达颗粒（主要成分包括葛根、人参、黄精、苍术、麦冬、黄连等）对糖尿病患者胰岛功能的影响，结果显示，所有患者治疗6个月后，治疗组总有效率为97.5%，而单纯西药对照组为87.5%，治疗后FPG、2hPG、HbA1c均明显降低，同时与胰岛素敏感性有关的HOMA-IR显著减低，而ISI明显升高。表明津力达颗粒能有效降低糖尿病患者血糖值，优化胰岛功能，提高糖尿病患者近期与远期疗效。吴寅和赵进东REF_Ref17375\r\h[37]研究发现，复方生津颗粒（天花粉、黄连、葛根、太子参、五味子、白芍组成）能显著改善气阴两虚型T2DM患者中医临床症状，可有效降低患者的血糖及空腹胰岛素指标，升高餐后2hC肽水平，降低稳态模型胰岛素抵抗指数，具有保护T2DM胰岛β细胞功能。呼家英和汤建芬REF_Ref17417\r\h[38]研究金芪降糖片（主要成分为黄连、黄芪、金银花等）治疗T2DM患者IＲ的临床效果，发现金芪降糖片可有效降低FPG、2hPG、FINS、HbA1c、胆固醇、甘油三酯、HOMA-IR，较好地改善患者的脂代谢、增加胰岛素的敏感性。郭俊杰等[39,40]研究表明：益气化浊胶囊（黄芪、女贞子、苍术、丹参、鬼箭羽、黄精、蚕茧）能够显著降低KKAy小鼠模型空腹血糖和胰岛素水平，降低HOMA-IR、血清三酰甘油、胆固醇水平，增加ISI。认为其作用机制主要是由于药物中多种成分参与到脂代谢、糖代谢、增加外周组织对葡萄糖的摄取和利用率、增加脂肪组织中胰岛素受体含量等多个环节，并通过整体、细胞、分子等不同水平的作用改善机体IR。当然，传统方剂在治疗糖尿病IR时也具有很好疗效。张慎枢REF_Ref17535\r\h[41]应用中药增敏汤（川芎、地骨皮、刺猬皮、葛根、鬼箭羽、脱敏散等）。与罗格列酮作对比研究，观察2组药物在降血糖和提高胰岛素敏感指数方面的差异，发现中药增敏汤与罗格列酮有相似的降血糖和增加胰岛素敏感性作用。郭春芳等REF_Ref17584\r\h[42]应用益气滋阴活血方治疗2型糖尿病患者40例，经过治疗，观察组患者治疗总有效率为明显高于对照组（P<0.05）；观察组患者治疗后的FBG、2hFBG、HbA1C指标明显优于对照组，且生存质量评分优良率高于对照组，并发症发生率低于对照组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。董方正等REF_Ref17613\r\h[43]应用滋脾汤治疗2型糖尿病52例，治疗组予每日1剂，分2次口服；对照组50例予胰岛素对症治疗。结果治疗组总有效率为88.4%优于对照组的76.0%，2组比较（P<0.05）。结论自拟滋脾汤治疗2型糖尿病疗效显著（P<0.05）。杨卫杰等REF_Ref17701\r\h[44]用玉消汤（白芥子、泽泻、枳实、汉防己、僵蚕、黄芪、白术、大黄、水蛭、三棱、莪术等）治疗2型糖尿病IR，有效率为90.91%，方中白芥子、枳实化痰消积、理气散结为君药;泽泻、汉防己利湿化浊为臣药;黄芪、白术益气健脾，僵蚕、大黄、水蛭、三棱、莪术活血化瘀、软坚散结为佐使，诸药合用共奏健脾化痰利湿、理气活血祛瘀之功。闫玲玲等REF_Ref17665\r\h[45]用祛胰抵方治疗2型糖尿病IR，君药以黄芪、人参、生地黄，重在补脾益气养阴;臣药以玄参、黄精、玉竹养阴润燥生津以除烦渴，茯苓健脾利水渗湿，苍术燥湿健脾祛痰，且可防诸药滋腻生痰;佐以黄连清胃火，水蛭、蜈蚣祛瘀通络，可明显减轻患者的IR指数，升高胰岛素敏感指数，降低血糖、糖化血红蛋白等指标。王永刚等REF_Ref17747\r\h[46]研究四黄降糖颗粒（黄芪、生地黄、黄连、大黄鬼箭羽）对2型糖尿病IR大鼠模型的降糖作用，发现四黄降糖颗粒有增强胰岛素敏感性和改善IR的作用。迟秀娥等REF_Ref17786\r\h[47]察清热祛浊胶囊（桑白皮、黄连、知母、枳实、泽泻、茯苓、大黄、红花、川牛膝、山药）对2型糖尿病合并代谢综合征患者IR的影响，发现清热祛浊胶囊与吡格列酮合用较单用吡格列酮疗效显著，能明显降低血糖、血压、HOMA-IR及调节血脂，这些作用可能均通过改善IR而实现。葛鹏玲等REF_Ref17822\r\h[48]观察花旗泽仁（西洋参、薏苡仁、泽泻等）对IR大鼠胰岛素敏感性的影响，发现花旗泽仁显著降低了血清FBG、FINS水平，升高了胰岛素敏感指数，说明花旗泽仁可以提高胰岛素敏感性而改善2型糖尿病IR。朱志章等REF_Ref17868\r\h[49]通过观察温脏扶正祛邪方联合西药降糖药对2型糖尿病IR证属虚寒者的作用，主方:红参、制附子、干姜、桂枝、杏仁、吴茱萸、黄芪、茯苓、白术、大枣、生姜，结果显示治疗组无论是在降糖方面还是在改善IR方面，都有确切疗效。仲怀中REF_Ref17910\r\h[50]运用榛黄解毒通络方（基本方:榛花、大黄、地黄、黄连、人参、丹参）加减治疗代谢综合征52例，除湿降浊、益气通络、扶正抗毒，取得满意疗效。吴深涛REF_Ref17956\r\h[51]认为糖尿病的IR系因肾虚、少阳不利兼瘀浊的病理变化，治疗须以益肾化瘀、疏利少阳为主，并以瓜蒌瞿麦丸合大柴胡汤化裁治疗取得满意疗效，基础方药由天花粉、山药、茯苓、附子、瞿麦等组成，水煎服，2次/日。此外，张一娇REF_Ref17992\r\h[52]观察丹栀逍遥散（当归、白芍、白术、柴胡、茯苓、煨姜、薄荷、牡丹皮、栀子、甘草）对2型糖尿病患者IR的影响，发现治疗组胰岛素敏感指数、稳态模型IR指数较对照组有显著改善，说明丹栀逍遥散可以显著增强2型糖尿病患者胰岛素的敏感性而改善IR。3总结中药治疗糖尿病在几千年的理论实践和临床实践中积累了丰富的经验，在治疗糖尿病中具有明显优势，而现代药理研究也证明中药可以通过多途径、多靶点降低血糖。一些中药的降糖作用机制已然明确，但依旧有不少的药物降糖机制及降糖成分不明确，甚至还有可能疏忽遗漏某些中药的潜在降糖作用。今后，中药在抗2型糖尿病胰岛素抵抗中的研究将会有很长的一段路程，各学者应抓住机会并迎接挑战，为糖尿病患者带来福音。参考文献汪会琴,胡如英,武海滨.2型糖尿病报告发病率研究进展[J].浙江预防医学,2016,28(1):37-57.李秀钧.代谢综合征(第2版)[M].北京:人民卫生出版社,2007.李娜,胡正芳,江振洲,等.中药抗糖尿病研究进展[J].药学与临床研究,2011,19(4):343-346王海焱,刘铜华.中药复方治疗2型糖尿病胰岛素抵抗的研究[J].西部中医药,2017,30(5):137-140.李娟,陈玲,张晓琳,等.红景天、蛹虫草、大黄配伍治疗代谢综合征的实验研究—改善胰岛素抵抗作用[J].中国中药杂志,2012,37(11)1614．江南,刘铜华.胰岛素抵抗的中医病机探讨[J].中国中医基础医学杂志,2006,12(9):691．朱友文,宋灿,霍海如,等.中药在2型糖尿病中的治疗和胰岛素抵抗中的研究进展[J].世界中医药,2015,10(1):135-137.纪云西,蒋历.胰岛素抵抗的中医病机实质探析[J].辽宁中医药大学学报,2008,10(3):23-24．王智明,魏子孝.从肝论消渴(糖尿病)的理论探讨[J].中国中医基础医学杂志,1999,5(4):34-35.施亚熊.肝脏胰岛素抵抗[J].中华糖尿病杂志,2010,2(4):308-309.徐丽君,曾凡鹏,陆付耳,等.补肾通脉方对2型糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素受体表达的影响[J].中国医院药学杂志,2003,23(4):201．龙新胜,郑晓东.浅析代谢综合征的中西医病因病机[J].天津中医药,2008,25(1):32-33.田晓慧.中药在治疗2型糖尿病胰岛素抵抗中的作用[J].中国实用医药,2013,8(33).赵轩,高彦彬.改善胰岛素抵抗的单味中药成分和机制研究[J].世界中医药,2013,8(7):840-843．李宗友.胡芦巴抗糖尿病和降胆固醇作用[J].国外医学中医中药分册,1999,21(4):9．程秀珍,刘玉坤,刘洪琪,等.葛根、丹参、大黄对2型糖尿病大鼠模型胰岛素抵抗的影响[J].中华实用中西医杂志,2007,20(17):1525-1527．乔琳琳,黄飞，闫小光,等.黄连煎剂对代谢综合征大鼠模型骨骼肌AMPK表达的影响[J].中华中医药杂志,2010,25(1):145-148．郑琳颖,潘竞锵,吕俊华.白芍总苷对脂肪肝大鼠增强胰岛素敏感性及抗脂肪肝作用[J].中国中药杂志,2008,33(20):2385．朱荣强，陈妍杰，陈小燕,等.黄芪注射液改善60例胰岛素抵抗临床观察[J].海峡药学,2011,23(5):117-118．WangQM,LiuC,ZhaoZP,etal.StudyofScreeningandeffectsofef-fect