禽流感疫苗研究进展

禽流感疫苗研究进展摘要对禽流感的防止，必须在采用严格的生物安全方法的同时，加强必要的免疫方法。对不同类型禽流感疫苗的研究现状、优越性与局限性进行了综述。核心词禽流感；疫苗；研究进展近来，亚洲某些国家不停暴发的禽流感（Avianinfluenza，AI）事件引发了人们对全球一系列动物和公众健康问题的极大关注，近来的联合国粮农组织（FAO）罗马提交会议指出[1]，当面临AI大流行威胁时，采用大规模扑杀感染动物的方法会丧失很大一部分食物来源，使地方养禽业遭受严重打击，显得不太合理。对禽流感的防止，必须努力集中在采用严格的生物安全方法的同时，加强必要的免疫方法。免疫能减轻临床症状，减少死亡率，减少病毒的扩散和提高群体对感染的抵抗力，从而控制禽流感病毒（Avianinfluenzavinus，AIV）的广泛传输[2]。然而，如果疫苗的使用和管理不当，不仅达不到预期的效果，还会污染环境，威胁公众健康。因此，研制安全、高效的AIV疫苗是专家们为之不懈努力的目的。抱负的疫苗应含有高的生物保护容量，同时消除环境污染和易感动物感染的可能性。总的来说，对于AIV疫苗的发展，下列几个设计思路均已被采用或尝试。1全病毒灭活疫苗由于AIV基因组的抗原漂移，AIV疫苗仅能提供70%的保护力。针对这种特点，AIV灭活疫苗普通制备成针对几个不同亚型AIV的多价疫苗，己证明1种灭活疫苗能够最少涉及4种不同的AIV亚型。同只含单一亚型的疫苗比，多价疫苗并没有削弱对同一种HA亚型AIV攻击的有效保护[3]，并且各亚型抗原之间不产生免疫干扰。AIV灭活疫苗能使免疫鸡群在感染AIV野毒时有效地减轻损失，并明显减少可能存在于鸡群和环境中的病毒数量，缩短其存活时间，是AI防治的主动方法、核心环节和最后防线。并且灭活疫苗含有制备工艺简朴、免疫效果确实、免疫持续期长等特点，许多国家已将其作为商品化的AIV疫苗应用于家禽中。我国己研制成功不同亚型的AIV疫苗，且证明含有良好的免疫保护作用。但灭活苗本身存在某些缺点[4]，重要是：影响疫情监测；存在散播病毒的风险；免疫剂量较大，制备成本高。其最突出的缺点是不能诱导产生有效的粘膜免疫抗体和细胞免疫应答，因而无法有效地克制呼吸道中AIV的复制。近年来，人们试图从技术上突破此缺点，筛选并运用同亚型弱毒疫苗株替代高致病性毒株制备灭活苗，是灭活苗研制中的努力方向之一。例如用2种不同的病毒同时感染鸡胚可造成片段间的重排而有可能产生所盼望的疫苗株，这些疫苗种子株获得了抗原有关毒株对应的HA和NA基因，和A/PuertoRico/8/34（H1N1）中的6个基因片段[5]。这些PR/8/34的片段赋予病毒弱毒因此能在鸡胚中快速生长，适合作为灭活疫苗的生产。2基因工程亚单位疫苗亚单位疫苗是提取AIV含有免疫原性的抗原蛋白，加入佐剂而制成。这种疫苗安全性好，能刺激机体产生足够的免疫力，只是抗体持续时间短，且成本高。谢愉快等曾用台湾AIV分离株（H8N4）的HA和NP制备了复合亚单位疫苗，同时制备了灭活的油佐剂疫苗。当以疫苗诱生的HI抗体作为评价原则时，发现2种疫苗的差别不明显，只是在加强免疫后，亚单位疫苗的HI抗体水平的升高比油佐剂疫苗明显[6]。随着基因工程技术的不停发展，将免疫原性基因导入体现载体，经诱导可获得大量体现的免疫原性蛋白，提取所体现的特定多肽，加入佐剂即制成基因工程亚单位疫苗，这样可大大减少疫苗的成本。Kodihalli等研制了火鸡H5N2病毒NP/HA和ISCOM的复合亚单位疫苗，用其免疫火鸡，21d可产生较高的抗体滴度，并且T、B淋巴细胞被激活，能够对同源和异源（H6N1）亚型病毒的攻击产生保护作用，在攻毒后3d，可去除火鸡肺部和泄殖腔的病毒[7]。另外，将AIV的基因插入杆状病毒体现载体，运用重组病毒在昆虫细胞中体现的AIV蛋白来制备AIV的亚单位疫苗也已研究成功。Crawford等运用杆状病毒体现系统生产H5、H7亚型AIV的重组HA佐剂疫苗，免疫3周龄白色Rock鸡，用同亚型HPAIV攻击，成果重组HA佐剂疫苗组全部的鸡只均不发病，而未免疫组鸡只全部死亡，且经H5亚型病毒的重组亚单位疫苗免疫过的鸡攻毒后都不排毒[8]。基因工程亚单位疫苗产生的抗体不针对病毒的内部蛋白，因此不会干扰AIV的血清学调查，并且其不存在毒力返强、散毒和环境污染的问题，是安全性较好的疫苗。重组杆状病毒体现的HA亚单位疫苗在禽类体现出良好的免疫原性，免疫后只诱导HA特异性抗体应答，不影响疫情监测，显示出了一定的应用前景。3重组活载体疫苗鸡痘病毒作为禽用疫苗病毒载体，含有外源基因容量大、可对体现的外源蛋白进行对的加工修饰、严格的宿主特异性和生物安全性等优点[9-11]，运用对禽类致病性很弱的痘苗病毒或禽痘病毒作载体，构建含有免疫原性基因的重组病毒，用此重组病毒作疫苗，可在动物体内复制，并不停地体现出免疫原性蛋白，从而诱导禽类产生针对目的病原的免疫保护力。Webster（1995）和Swaynes（1997）先后构建了含A/Ty/Ire/1378/83（H5N8）HA基因的禽痘病毒重组疫苗，用其免疫仔鸡，用在墨西哥分离的致死性强毒H5N2攻击，实验成果证明该苗可对H5N2提供0%～100%的保护[12]；冀德君、刘红旗等应用体现H9亚型AIVHA的重组鸡痘病毒疫苗及其传代后第20、30代疫苗免疫5日龄无特定病原（SPF）鸡群，攻毒后第5天各免疫组排毒的鸡数与对照组相比明显减少[13]；程坚等用体现H9亚型AIVHA基因的重组鸡痘病毒在7日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡上进行的免疫效力实验亦表明，重组鸡痘疫苗能明显克制静脉攻毒后免疫鸡从泄殖腔的排毒，效果与AIV全病毒灭活苗相称[14]。贾立军用构建的体现H5N1HA的重组鸡痘疫苗免疫SPF鸡和无母源抗体的商品鸡，免疫鸡可抵抗H5N1亚型HPAIV的致死性攻击，诱导95%～100%的免疫保护[15]。陈平用构建的高效体现H9亚型AIVHA基因的重组鸡痘病毒颈部皮下免疫1日龄SPF鸡，攻毒后实验成果表明，rFPV-Ps-HA明显克制了病毒的排出[16]。以上实验均表明，携带AIVHA基因的重组鸡痘疫苗含有良好的效果。同灭活苗相比，携带HA基因的重组活载体疫苗不仅可提供相称的保护效果，并且含有某些独特的优点：安全性高；可通过刺种和皮下注射接种途径进行免疫，使用方便；免疫应激小；用量少，不需添加佐剂，成本大大减少；并且抗体持续时间长，效果好，用其免疫家禽，既可刺激宿主产生体液免疫，又能刺激宿主产生细胞免疫[17]。基因重组的鸡痘疫苗的最大优点是不干扰血清学调查，因此该重组疫苗合用于监测野毒感染[4]。4DNA疫苗Ulmer等[18]报道了小鼠肌肉注射含有编码甲型流感病毒核蛋白（NP）的重组质粒后，不仅产生抗NP的特异性IgG抗体，并且诱导CTL反映，可有效地保护小鼠抗不同亚型分离时间相隔34a的流感病毒的攻击。Pertmer发现，流感病毒NP基因的核酸疫苗激活机体的免疫反映不受母源抗体的干扰[19]。同样，在有母源抗体存在的状况下，HA和NP基因均能有效激活细胞免疫应答反映。我国研制的H7亚型HA基因DNA疫苗，在极小的使用剂量下即可成功诱导免疫保护反映，并有效阻断同源MPAIV在机体内的感染和排毒[20]。大量的动物实验都阐明在适宜的条件下，DNA接种后既能产生细胞免疫又能产生体液免疫[21-24]，于是，DNA疫苗技术应运而生，并逐步显示出它作为第3代疫苗的优越性。与传统疫苗相比DNA疫苗有许多优点：能长时间体现抗原；含有与天然抗原相似的构象和免疫原性，可同时激发机体产生细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫应答，并且不受母源抗体的干扰；构造简朴，制备方便；稳定性好，易于保存和运输；能够克服由于免疫系统发育不完善而造成的免疫力低下的缺点；可用于制备多价疫苗或联苗。本文为全文原貌未安装PDF浏览器顾客请先下载安装原版全文现在，对于DNA疫苗存在着安全方面的考虑：质粒DNA低水平整合到宿主基因组的潜在危险性；DNA疫苗载体携带的抗生素基因可能造成的生物学后果；产生针对双链DNA的抗体；引发免疫耐受。针对上述四种潜在的危害性，美国FDA、WHO及EU都对DNA疫苗的研制制订了某些指导性规定，为DNA疫苗的研究、生产及应用指明了方向。由于DNA疫苗代价相对较高，且不适于集约化养殖的群体免疫，因此可考虑改善DNA疫苗生产工艺和优化疫苗接种方式来开发出价格低廉、实用化的DNA疫苗。其中应用减毒胞内菌运输DNA疫苗的途径获得了某些令人振奋的成果。已有了某些比较好的减毒沙门氏菌菌株作为禽类DNA疫苗的运输载体的研究报道，张小荣等以减毒沙门氏菌运输H5亚型AIVDNA疫苗的生物学特性研究表明，该疫苗含有良好的安全性和免疫原性，能同时激发细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫应答[25]，这类疫苗仍在探讨中，需对这类疫苗进行进一步优化，才干最后筛选出真正适合临床应用的疫苗。5RNA复制子疫苗随着DNA疫苗的进一步研究，人们紧张DNA会整合到宿主细胞基因组上，造成致癌隐患。另外，DNA通过核膜较为困难，限制了其作用的发挥，在一定程度上妨碍了DNA疫苗的推广应用。于是，人们又构想用RNA替代DNA作基因疫苗，近年来开发的RNA复制子载体应运而生。该RNA复制子能够不依赖于宿主细胞而自主复制，包含病毒基因组5’和3’末端的顺式作用元件、全部非构造蛋白基因编码区（涉及复制酶编码基因），而构造蛋白基因被缺失，由外源基因取代，这种重组病毒粒子能够很容易地携带达3kb的外源RNA，并且感染的细胞谱较广，涉及非分裂细胞[26]。Vignuzzi等[27]将A型流感病毒A/PR/8/34（ma）株的NP基因插入塞姆利基森林病毒（SFV）载体上构建RNA疫苗，7～8周龄的C57BL/6老鼠肌肉注射10μgSFVRNA，3～4周后再加强1次，共免疫3次。第3次免疫后1～3周，由鼻腔攻入100pfu的A/PR/8/34（ma）病毒。实验成果不仅有较高的中和抗体出现，并且诱导了有效的CTL反映，实验小鼠能有效去除肺部的病毒。大量的研究证明DNA/RNA复制子比常规DNA疫苗的免疫原性好[28]，能够产生更强的抗体应答和更多的CTL前体，并且使用比常规DNA疫苗免疫剂量低100倍的复制子疫苗就能够产生与常规DNA疫苗相称的免疫效力。可见，RNA复制子载体的特点涉及：复制效率高，用量远远低于常规DNA疫苗；可同时诱导抗体应答和CTL应答；安全性好，RNA复制子在胞浆内复制，避免了核的参加，不存在整合进宿主基因组的可能性；RNA复制子造成转染细胞的溶解，避免了有自主复制能力的病毒的产生；复制子系统能自主复制，可针对多个病原进行持续免疫，而不受己有载体病毒抗体的干扰。6冷适应流感弱毒疫苗用野毒株感染鸡胚在较低温度下（25～30℃）培养，持续传代后可较快的使病毒的致病力削弱，从而获得冷适应流感弱毒病毒供体。通过在体现靶HA和NA的野生型病毒和病毒供体如A/AnnArbor/6/60（H2N2）之间的基因重排能够获得减毒的冷适应性病毒株，病毒的这些特性与多基因的突变有关。滴鼻免疫减毒的冷适应性的流感活疫苗，能引发全身和局部粘膜的免疫反映，显示出保护效力[29]。这些活的减毒病毒显示出高水平的表型和基因稳定性，不会转变成靠近的有关血清学阴性毒株。已经获得H5N1和H9N2/Ann供体的重组冷适应性病毒。这些病毒不会对哺乳动物和鸡致病[30]。即使现在流行的肌注禽流感疫苗能够有效地诱导有关病毒特异的血清血凝克制IgG抗体，他们却不能刺激鼻腔产生分泌型IgA抗体[31]。由于分泌型IgA能与异源型的流感毒株交叉反映，活的减毒的禽流感疫苗能够广泛地提供针对抗原变异株的交叉保护，一旦新的流感毒株流行时它将非常有用[32，33]。美国对冷适应流感弱毒疫苗的研制己有30数年的历史，但由于紧张其安全性，至今仍未被同意使用。俄罗斯是现在全球唯一人流感冷适应流感弱毒疫苗获准使用的国家，该疫苗己在数亿小朋友中使用，证明能提供良好的保护，并无不良反映。到现在为止，无论俄罗斯还是全球，没有流感病毒扩散的迹象[34，35]，但活的AIV疫苗病毒仍有与人类共感染毒株发生基因重组，或毒力返强，造成新的流感毒株出现的可能，对其大面积的推广使用，还需在生物安全性方面加以时间上的验证。7复制缺点型流感病毒疫苗用反向遗传系统可获得减毒的AIV，在流感流行时对疫苗的供应可能会起很核心的作用。病毒的HA和NA基因被克隆并插入到质粒中，通过去除HA的多个碱性氨基酸裂解位点序列使其减毒，插入了HA和NA的质粒与携带A/PR8/34病毒内部基因的质粒共转染细胞系产生对应的非致病性疫苗株。采用该办法产生的疫苗不仅能产生保护性抗体，并且能诱导很强的细胞免疫，是另一种很有发展前途的活疫苗。此疫苗能够在几个星期内获得，从而能应付紧急流感大流行事件来临时疫苗的需求。Watanable等[36]运用反向遗传学从cDNA获得NS2蛋白缺失的病毒粒子，用其感染细胞时，能在细胞内体现病毒蛋白但不能形成有感染力的病毒粒子，用此办法制成的疫苗能保护离最后1次免疫3个月后的老鼠接受10或100LD50的攻击（9只老鼠存活8只）。其它获得复制缺点型流感病毒疫苗的途径是使M2基因缺失[37]。此缺失疫苗在组织培养物中生长良好，但在老鼠体内有限生长，因此是一潜在的活疫苗候选。即使重组减毒的H5病毒在小鼠中只含有限的神经毒力，但其符合抱负模式的疫苗设计特点――不会致死鸡胚、削弱的毒力、对模型动物含有易感性，已经开始运用于生产，但是在疫苗生产技术被采用之前仍有某些规章，安全性以及正当性问题需要考虑和克服。在生产人用疫苗时用于转染的哺乳动物细胞系（如vero细胞）的质量必须符合原则。用反向遗传系统产生的病毒可能被认为是“基因改良的有机体”，因此各个国家强加了某些地方和民众的安全性法则限制其研究和发展，并且高科技的反向遗传技术的使用权被保存，需要通过许可才干采用此办法生产商业化疫苗。8表位疫苗根据病毒的抗原表位来研制表位疫苗，特别是为易变异的病毒疫苗的研制提供了方向。Levi等[38]将流感病毒的3个表位：Ｂ细胞表位HA91-108、CTL表位NP147-158、Th细胞表位NP55-69分别插入沙门氏菌的鞭毛蛋白基因中构建了3个真核体现质粒，鼻腔免疫小鼠。3种质粒混合免疫组能够诱导长久的免疫应答，并且能够完全抵抗病毒的致死性攻击。Thomson等[39]以1个真核体现质粒投递了10个CTL抗原表位，其中涉及NP基因的3个表位：NP50-58、NP147-155、NP366-374和NS1基因的1个表位NS1152-160，免疫鼠后通过Cr51释放实验，检测这些表位显示该质粒诱导了强的CTL应答，并且能够去除感染的病毒。表位疫苗不仅提供了一种更有效地运用病原体中各个抗原成分的办法，并且对于流感病毒这种高度变异的病毒来说，首先能够通过选择含有交叉保护性的表位来达成防止多个毒株的目的，另首先能够通过对流行毒株的监测来及时合成表位，实现对变异毒株的控制。本文为全文原貌未安装PDF浏览器顾客请先下载安装原版全文9转基因植物疫苗宋长征等运用转基因马铃薯体现AIVHA蛋白[40]。运用电击穿孔转化法，将含有AIVHA基因的体现质粒pHAO（其中含35S启动子和来源于大豆植物存储蛋白基因的vspB终止末端，另有抗性标记）导入农杆菌EHA105，转化细菌再感染马铃薯的幼茎外植体，转化植株再生和温室栽培。Westernblot分析表明，83%的转化植株在其马铃薯块茎组织中体现了重组HA，体现量占总蛋白量的0.03%～0.04%。成果显示，用转基因马铃薯生产口服AIV疫苗是有前景的。10参考文献[1]IlariaCapua，StefanoMarangon.VaccinationforavianinfluenzainAsia[J].Vaccine，（22）：4137-4138.[2]JamesMarkSimmerman，PraneeThawatsupha，DarikaKingnatec，etal.InfluenzainThailand：acasestudyformiddleincomecountries[J].Vaccine，（23）：182-187.[3]唐秀英，田国斌，于康震，等.禽流感油乳剂灭活苗的研究[J].中国防止兽医学报.1999，21（6）：401-405.[4]DLSuarez，SSchultz-Cherry.Immunologyofavianinfluenzavirus：areview[J].Developmental&ComparativeImmunology.，24（2-3）：269-283.[5]FURMINGERIGS.Vaccineproduction[M]∥NICHOLSONKG，WEBSCERRG，HAYAJ，etal.Thetextbookofinfluenza.Oxford：Blackwell，1998：325-332.[6]陈全娇，金梅林，陈焕春.禽流感疫苗研究进展[J].中国生物工程杂志，，24（4）：34-38.[7]KODIHALLIS，SIVANANDANV，NAGARAJAKV，etal.Atypespecificavianinfluenzavirussubunitvaccineforturkeys：inductionofprotectiveimmunitytochallengeinfection[J].Vaccine，1994（15）：1467-1472.[8]CRAWFORDJ，WILKINSONB，VOSNESENSKYA，etal.Baculovirus-derivedhemagglutininvaccinesprotectagainstlethalinfluenzainfectionsbyavianH5andH7subtypes[J].Vaccine，1999，17（18）：2265-2274.[9]MOSSE.Geneticallyengineeredpoxvirusesforrecombinantgeneexpression，vaccination，andsafety[J].PNAS，1996（93）：11341-11348.[10]BOYLEDB，HEINEHG.Recombinantfowlpoxvirusvaccinesforpoultry[J].ImmunolCellBiol，1993，71（5）：391-397.[11]BOYLEDB，COUPARBE.Constructionofrecombinantfowlpoxvirusesasvectorsforpoultryvaccines[J].VirusRes，1988，10（4）：343-356.[12]KAWAOKAY，NAEVECW，WEBSTERRG.IsvirulenceofH5N2influenzavirusesinchickensassociatedwithlossofcarbohydratefromthehemagglutinin?[J].Virology，1984，139（2）：303-316.[13]冀德君，刘红旗，彭大新，等.H9亚型禽流感重组鸡痘病毒疫苗的免疫保护实验[J].扬州大学学报，，23（2）：13-16.[14]程坚，刘秀梵，彭大新，等.体现H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力[J].微生物学报，，42（4）：442-447.[15]贾立军，彭大新，张艳梅，等.H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗的构建及其遗传稳定性与免疫效力[J].微生物学报，，43（6）：722-727.[16]陈平，陈素娟，彭大新，等.高效体现H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建及免疫效力实验[J].中国兽医学报，，24（3）：216-218.[17]SWAYNEDE，GARCIAM，BECKJR，etal.ProtectionagainstdiversehighlypathogenicH5avianinfluenzavirusinchickensimmunizedwitharecombinantfowlpoxvaccinecontaininganH5avianinfluenzahemagglutiningeneinsert[J].Vaccine，（18）：1088-1095.[18]ULMERJB，DONNELLYJJ，PARKERSE，etal.HeterologousprotectionagainstinfluenzabyinjectionofDNAencodingaviralprotein[J].Science，1993（259）：1745-1749.[19]PERTRNERTM，ORANAE，MOSERJM，etal.DNAvaccinesforinfluenzavirus：differentialeffectsofmaternalantibodyonimmuneresponsestohemagglutininandnucleoprotein[J].Jvirol，（74）：7787-7793.[20]陈化兰，于康震，田国斌，等.禽流感病毒血凝素基因的克隆及其DNA疫苗的免疫原性[J].中国兽医学报，1997，17（6）：555-558.[21]KODIHALLIS，GOTOH，KOBASADL，etal.DNAvaccineencodinghemagglutininprovidesprotectiveimmunityagainstH5N1influenzavirusinfectioninmice[J].JVirol，1999，73（3）：2094?2098.本文为全文原貌未安装PDF浏览器顾客请先下载安装原版全文[22]MITCHELLJA，GREENTD，BRIGHTRA，etal.InductionofheterosubtypicimmunitytoinfluenzaAvirususingaDNAvaccineexpressinghemagglutinin-C3dfusionproteins[J].Vaccine，，21（9-10）：902-914.[23]EPSTEINSL，TUMPEYTM，MISPLONJA，etal.DNAvaccineexpressingconservedinfluenzavirusproteinsprotectiveagainstH5N1challengeinfectioninmice[J].EmergInfectDis，，8（8）：796-801.[24]ULMERJB.InfluenzaDNAvaccines[J].Vaccine，，20（2）：74-76.[25]张小荣，焦新安，潘志明，等.以减毒沙门氏菌运输的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的构建及其对小鼠的免疫原性[J].微生物学报，，44（2）：157-161.[26]SCHLESINGERS，DUBENSKYTW.Alphavirusvectorsforgeneexpressionandvaccines[J].CurrOpinBiotechnol，1999（10）：434-439.[27]VIGNUZZIM，GERBAUDS，WERFSYLVIEVANDER，etal.NakedRNAimmunizationwithrepliconsderivedfrompoliovirusandSemLikiForestvirusgenomesforthegenerationofacytotoxicTcellresponseagainsttheinfluenzaAvirusnucleoprotein[J].JournalofGeneralVirology，（82）：1737-1747.[28]DUBENSKEYTW，LIUMH，ULMERJB.Deliverysystemsforgenebasedvaccines[J].MolecularMedicine，（6）：723-732.[29]CHAT，KAOK，ZHAOJ.Genotypicst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