树状多抗原肽的合成

树状多抗原肽的合成

由树脂酸严格设计和控制分子的大小、形状和结构。这些特点使其在模拟大生物分子的功能上有巨大的潜力,如可用作药物载体或用作合成多肽疫苗的免疫原等。树状的多抗原肽不需与载体蛋白相连而能很好地诱导免疫反应,与直链多肽相比可更好地与特异性抗体相结合。在含有不同抗原肽的树状多抗原肽合成中,其中的一个关键步骤是合成正交保护的赖氨酸。利用赖氨酸的两个氨基合成含有不同抗原肽的树状多抗原肽时,必须将这两个氨基正交保护,在脱去一个氨基保护基时,另一个氨基保护基不受影响,从而可接上两个不同序列的肽段。此外,在环肽、分枝肽、糖肽的合成中,以及肽的片段缩合中,各种各样的正交保护的赖氨酸也起着很重要的作用。由于树状、环状、分枝多肽合成中所用的保护基需要在比较温和的条件下脱去,我们设计并合成了下列未见文献报道的正交保护的赖氨酸:Dde—Lys(Z)—OH,Dde—Lys(Aloc)—OH,Aloc—Lys(Z)—OH,Z—Lys(Aloc)—OH其中,Fmoc可以在20%哌啶/DMF中脱去,Z在催化氢解下脱去,Aloc在零价钯和亲核试剂存在条件下脱去,Dde在2%肼/DMF中脱去。同时,为满足合成需要还合成了:Fmoc—Lys(Aloc)—OH,Dde—Lys(Fmoc)—OH这些正交保护的赖氨酸将在双抗原肽树状多肽的合成中得到应用。正交保护赖氨酸的合成路线如下:1改性氨基酸铜络合物首先利用赖氨酸α位的氨基和羧基与铜易形成络合物,先选择性地将ε位的氨基与酰化试剂Z—Cl、Aloc—Cl和Fmoc—Cl反应得到ε位的氨基分别被Z、Aloc和Fmoc保护的赖氨酸铜络合物,但当试图用DdeOH保护赖氨酸的ε位氨基时,由于DdeOH与铜的络合能力更强,而得到DdeOH的铜络合物,不能得到目标化合物。对于比较稳定的ε位Z保护的赖氨酸铜络合物,由于其在水中的溶解性差,将其在盐酸中溶解后通入H2S,然后用氨水中和得到产物;对于ε位Aloc保护的赖氨酸铜络合物,因其在水中的溶解性较好,在加热条件下直接通入H2S,可以得到解离完全的产物;对于ε位Fmoc保护的赖氨酸铜络合物,由于Fmoc对碱不稳定,使用EDTA二钠盐解离络合的铜,条件温和,缺点是解离时间较长方可达到完全。ε氨基保护的赖氨酸经碱(NaOH或Na2CO3)将α位的氨基从其内盐解离出来后,与Z—Cl、Aloc—Cl和Fmoc—Cl反应,即可得到部分正交保护的赖氨酸,反应后用有机溶剂萃取除去过量的Z—Cl、Aloc—Cl或Fmoc—Cl,酸化后再用有机溶剂萃取得到比较纯净的产物,可以避免柱层析分离。在用DdeOH保护ε氨基保护的赖氨酸的α位氨基时,反应需脱水,不利于在水中反应,但在有机溶剂中由于赖氨酸以内盐形式存在,使其溶解性很差,故反应时间长且不够彻底。以DMF或乙醇作溶剂,DMF反应程度和速度较乙醇好,但除去DMF比除去乙醇困难。以溶解能力较强的NMP(N-甲基吡咯烷酮)为溶剂进行反应,反应程度和速度均得到提高,但NMP的沸点很高,难以除去。综合以上因素,我们认为无水乙醇是较为理想的溶剂。2以碳醇为原料的aloc-cl和cy仪器:BRUKERINSTRUMBIFLEXⅢ质谱仪,VARIANMERCURY200MHz核磁共振仪,Carlo-Erbla元素分析仪按文献合成,Z—Cl和Aloc—Cl用苄醇和烯丙醇通入光气得到。2.2-氨基酸和氨基酸的合成根据文献可合成出H2N—Lys(Fmoc)—OH,H2N—Lys(Z)—OH,H2N—Lys(Aloc)—OH。2.3正交保护氨基酸合成2.3.1油混合物cde400mg(1.43mmol)H2N—Lys(Z)—OH和260mg(1.43mmol)DdeOH分别悬浮和溶解于10mLDMF中,回流30h,TLC检测反应终止,Rf=0.48(CHCl3:MeOH=7:2V/V),浓缩后柱层析分离(CHCl3:MeOH从20:1到6:1(V/V)梯度洗脱),得到油状物300mg,产率45%。质谱(C24H32O6N2):(MALDI-TOF)m/z,445(M+H)+,467(M+Na)+,489(M+2Na-H)+。1HNMR(200MHz,CDCl3)W:0.93(6H,s,DdeMe2),1.35(4H,m,CγH2CδH2),1.79(2H,m,CβH2),2.28(4H,s,Dde2CH2),2.40(3H,s,DdeC=CMe),3.41(2H,m,ε2),4.24(1,,α),5.01(2,,—2),5.56(1,,ε),7.27(5,),13.46(1H,brs,NαH氢键).元素分析(C24H32O6N2,444.53),实验值(%):C64.52,H6.95,N5.97;计算值(%):C64.85,H7.26,N6.30。2.3.2质谱ms将0.8g(3.5mmol)H2N—Lys(Aloc)—OH和0.63g(3.5mmol)DdeOH溶于15mL无水乙醇中,回流40h,TLC(CHCl3:MeOH=7:2V/V,Rf=0.41)测反应终止,蒸除溶剂后,残余物用CHCl3:MeOH从20:1到8:1(V/V)梯度洗脱柱层析分离,到浅黄色油状物产率质谱203062H)+,1HNMR(200MHz,CDCl3)δ:1.04(6H,s,Dde,Me2),1.52(4H,m,CγH2CδH2),1.96(2H,m,CβH2),2.40(4H,s,Dde2CH2),2.53(3H,s,DdeC=CMe),3.47(2H,m,CεH2),4.42(1H,m,CαH),4.54(2H,m,AlocCH2),5.24(2H,m,AlocCH2=),5.58(1H,brs,NεH),5.90(1H,m,AlocCH=),13.78(1H,brs,NαH氢键).元素分析(C20H30O6N2,394.47),实验值(%):C61.20,H7.70,N6.89;计算值(%):C60.90,H7.67,N7.10。2.3.3余物柱层析分离500mg(1.4mmol)H2N—Lys(Fmoc)—OH,246mg(1.4mmol)DdeOH溶于15mL无水乙醇中,回流35h,TLC检测反应终止,产物Rf=0.46(CHCl3:MeOH=7:2V/V),蒸除溶剂后,残余物柱层析分离(CHCl3:MeOH从20:1到7:1(V/V)梯度洗得到浅黄色油状物产率质谱313662+555(M+Na),577(M+2Na-H);HNMR:(200MHz,CDCl3)W:0.91(6H,s,DdeMe2),1.33(4H,m,CγH2CδH2),1.80(2H,m,CβH2),2.24(4H,s,Dde2CH2),2.39(3H,s,DdeC=CMe),3.02ε22αεArH),8.02(1H,s,CαOOH),13.58(1H,brs,NαH氢键).元素分析(C31H36O6N2,532.64),实验值(%):C69.74,H7.15,N5.19,计算值(%):C69.91,H6.81,N5.26。2.3.4水相氧化酶的提取将400mg(1.43mmol)H2N—Lys(Z)—OH悬浮于6mLH2O中,冰盐浴冷却下,滴加0.36mL4mol/LNaOH,使固体溶解。然后加入烯丙氧羰氯0.5mL(516mg,4.29mmol)及15～20滴4mol/LNaOH,剧烈搅拌,反应过程中始终保持酚酞显红色(pH9～10)。室温反应15min,用乙醚洗去过量的Aloc—Cl然后用浓盐酸将水相酸化到pH为3～5。用乙酸乙酯萃取,有机相用饱和NaCl溶液洗至中性。无水硫酸钠干燥,旋去溶剂,得到无色油状物410mg,f=0.45(3:=7.2/),产率79%,质谱(C18H24O6N2):(-)/,387(M+Na)+。1HNMR(200MHz,CDCl3)W:1.45(4H,m,CγH2CδH2),1.78(2H,m,CβH2),3.16(2H,m,CεH2),4.37(1H,m,CαH),4.55(2H,m,AlocCH2),5.08(2H,s,ZCH2),5.24(2H,m,AlocCH2=),5.65(1H,m,NαH),5.85(1H,m,AlocCH=),6.19(1H,m,NεH),7.34(5H,s,ArH),8.18(1H,s,CαOOH).元素分析(C18H24O6N2,364.40),实验值(%):C59.66,H6.68,N7.57;计算值(%):C59.33,H6.64,N7.69。2.3.5油物特性分析将1g(4.3mmol)H2N—Lys(Aloc)—OH置于25mL三口瓶,2.5mL2mol/LNaOH,,2.5mL(7.5mmol)Z—Cl,2mol/LNaOH,以保持pH为9,加毕,反应1h,注意维持pH在9左右。用乙醚洗两次。水层滴6mol/LHCl到pH=1,用乙酸乙酯萃取。用5%NaCl水溶液洗至中性,无水硫酸钠干燥,除去溶,得到油状物0.9g,产率58%。Rf=0.56(CHCl3:MeOH=7:2)。质谱(C18H24O6N2):(MALDI-TOF)m/z,387(M+Na)+,403(M+K)+,1HNMR(200MHz,CDCl3)W:1.45(4H,m,CγH2CδH2),1.77(2H,m,CβH2),3.14(2H,m,CεH2),4.36(1H,m,CαH),4.54(2H,m,AlocCH2),5.10(2H,m,ZCH2),5.23(2H,m,AlocCH2=),5.85(1H,m,AlocCH=),6.28(1Hbrs,NαH),7.10(1H,brs,NεH),7.33(5H,s,ArH),9.81(1H,s,CαOOH).元素分析(C18H24O6N2,364.40),实验值(%):C59.60,H6.78,N7.61;计算值(%):C59.33,H6.64,N7.69。2.3.6饱和na2co3法0.7g(2mmol)H2N—Lys(Aloc)—OH溶于6mL二氧六环和6mL水,加入424mg(4mmol)Na2CO3,搅拌溶解,滴加0.5g(2mmol)Fmoc—Cl的5mL二氧六环溶液。控制滴加速度不使Fmoc—Cl沉淀。在滴加时不断滴入饱和Na2CO3以保持反应液pH在9左右。滴加完毕,室温搅拌3h。用6mol/LHCl中和到pH为2,用乙酸乙酯提取,水洗,无水硫酸钠干燥旋去溶剂得到油状物重结晶后得到白色固体收率89℃(88～90℃).1HNMR:(200MHz,CDCl3)W:1.45(4H,m,CγH