α淀粉酶抑制剂的研究进展剖析

目录TOC\o"1-3"\h\u摘要 1核心词 1Abstract 1Keywords 1引言 21α-淀粉酶克制剂的介绍 21.1α-淀粉酶克制剂的来源 21.2α-淀粉酶克制剂的特性研究 32α-淀粉酶克制剂的制备 42.1来源于天然植物的α-淀粉酶克制剂 42.11豆类植物 42.12麦类植物 52.13齿苋类植物 52.14其它植物 62.2来源于微生物的α-淀粉酶克制剂 63α-淀粉酶克制剂的分离纯化 74α-淀粉酶克制剂的检测办法 84.1碘比色法 84.23,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法 85α-淀粉酶克制剂的筛选办法 96α-淀粉酶克制剂的研究进展 96.1国内外研究概况 9α淀粉酶克制剂的研究进展摘要：α-淀粉酶克制剂是一种糖苷水解酶克制剂。克制糖类消化吸取药品，减少糖分的摄取，减少血糖和血脂含量，还可作为抗虫基因。现在在医学和农业上含有广泛的用途。本文对α-淀粉酶克制剂的制备、检测、筛选办法、特性以及发展进行了综述，并对其前景作了展望。核心词：α-淀粉酶克制剂，制备，检测，筛选办法，特性Researchprogressofα-amylaseinhibitorAbstract:α-amylaseinhibitorisakindofglycosidehydrolaseinhibitor,Itcanbepotentiallyuseasmedicinesofdiabetesowingtoinhibitingglucosefrombeingabsorbedinthedigestivetracts.Whichcanreduceingestionofsugarandbloodfatcontetandhashypoglycemicactivity,anditsgenecanbeusedasinsect-resistantgenesincropsbreeding.Thereiscomprehensive,applicationinagricultureandmedicine.Thepreparation、detection、screeningmethods、characteristicsanddevelopmentoftheα-amylaseinhibitorswerereviwedinthispaper,andtheprospectswereforecasted.Keywords:α-amylaseinhibitor,preparation,detection,screeningmethods,characteristics.引言α-淀粉酶克制剂属于糖苷酶克制剂的一种，是一种纯天然生物活性物质，重要存在于植物种子、胚乳和微生物代谢产物中，现在在医药和农业上含有广泛的用途。α-淀粉酶克制剂能够有效的克制肠道内唾液及胰淀粉酶的活性，妨碍食物中碳水化合物的水解和消化，减少糖分的摄取，减少血糖的血脂含量水平。食用后不产生高血糖，从而胰岛素分泌减少，脂肪合成减少，体重减轻。临床医学上用于防治糖尿病、高血糖、高血脂等病症；农业上α-淀粉酶克制剂基因能够作为抗虫基因，减少杀虫剂的使用。另外，在酶学研究方面，可作为探究α-淀粉酶活性部位的分析工具，作为通过选择作用测定α-淀粉酶同工酶的反映物，作为蛋白质与蛋白质之间识别和互相作用的模林体系等方面含有内在效应。α-淀粉酶克制剂应用已被广泛进一步研究，本文对α-淀粉酶克制剂研究进展作一概述。1α-淀粉酶克制剂的介绍1.1α-淀粉酶克制剂的来源大多数α-淀粉酶克制剂已从微生物源（重要集中在链霉菌属）、植物源（植物中普遍存在，特别是禾谷作物和豆类作物的种子）获得，少数从哺乳动物中获得，并且也在合成物质中发现过。天然存在的α-淀粉酶克制剂有三种类型[1]分别为：（1）微生物产带一种寡生物胺单位的含氮碳水化合物；（2）微生物产多肽，如paim（来自微生物的猪胰腺α-淀粉酶克制剂）和Haim（微生物来源人α-淀粉酶克制剂）；（3）在谷类、豆类以及其它较高等植物中发现的大分子蛋白质克制剂。1.2α-淀粉酶克制剂的特性研究普通的α-淀粉酶克制剂都是些有机化合物，它们与酶形成酶克制剂复合物而使酶失活。在化学构造上，它们能够是蛋白质、多肽和碳水化合物[2]。根据它们的化学性质，因来源不同其化学物理特性而不同。由多个不同的链霉菌属种产生的淀粉酶克制剂含有低的分子量，大概在500~Da（道尔）之间，并且是α-淀粉酶中非常有效的克制剂，它们有三种类型（1）oligostatins寡糖制菌素：（2）amylosatins制淀粉酶素：（3）tresatins。它们共用有拟双糖单元工寡生物胺或脱氢寡生物胺，不同数目α-D-葡萄糖基团以α-1，4糖苷键连接，而在tresatins中与一种α-1，1-糖苷键葡萄糖连接。这个含N个碳水化合物对几个葡萄苷酶涉及α-淀粉酶有克制作用。Tajiri等报道从链霉菌属中产生α-淀粉酶克制剂含有14种肽，某些是如上所述的含N个碳水化合物，另某些是分子量为3936-8500Da之间的聚合肽，它们是由单个多肽链构成，且不含碳水化合物，含有质序列同源性，特别重要的是位于18~20的WRY序列和位于59~70的氨基酸，它们被认为和α-淀粉酶的结合有关。X射线衍射晶体分析法显示的三级构造，表明WRY序列在分子表面明显呈现，而位于59~70氨基酸残基邻近DEF序列。含有活性的蛋白质从小麦、大麦、小米、高粱、谷物、花生、大豆、芋头根和某些其它植物中分离。克制剂分子量范畴为9KD~63KD。另外复合克制剂因其克制的特异性不同普通可能为同工酶，已有某些复合克制剂从小麦、大麦及小米中被分离。2α-淀粉酶克制剂的制备现在，国内外对于α-淀粉酶克制剂的研制大都经历下列程序：原料→粉碎→水浸→离心分离→上清液→盐析（沉淀再溶解）→加热灭酶→离心分离α-淀粉酶克制→上清液→透析→浓缩→干燥→成品但是根据原料的不同，α-淀粉酶克制剂的生产过程又存在着较大的差别，下面就从天然植物和微生物两个方面介绍α-淀粉酶克制剂的加工工艺。2.1来源于天然植物的α-淀粉酶克制剂天然的α-淀粉酶克制剂重要存在于植物种子的胚乳中,现在已经从小麦、豆类、薯蓣、野生苋属等植物种子中分离得到α-淀粉酶克制剂。2.11豆类植物从白豆中提取的α-淀粉酶克制剂活性较高,对哺乳动物胰α-淀粉酶有很强的克制作用。杨明琰等采用乙醇分级沉淀、CMⅡ纤维素离子交换柱层析及凝胶柱层析,从白豆中分离纯化得到相对分子量为3ku的白豆α-淀粉酶克制剂,其对淀粉酶的克制类型属于非竞争性克制剂[3]。杨秀芳等将白豆在20℃水中浸泡24h,向浸透的白豆中加入0.1mol/L的磷酸钠缓冲溶液,研磨,匀浆[4]。浆液离心,上清液用0.1mol/L的HCl酸化至pH5.0,再用冷冻离心机4℃离心10min,在该酸化液中加入硫酸铵使饱和度达成50%,静置20h,离心沉淀蛋白,溶于0.05mol/L的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液中,放入透析袋,在相似缓冲溶液中透析1d,得酶液。Dayler等运用酸性缓冲液从一种名为P.Vulgaris的豆中提取出α-淀粉酶克制剂,用DEAE-Cellulose和反相高效液相特殊设备,经梯度洗脱得到α-淀粉酶克制剂的异构体α-淀粉酶克制剂Ⅰ。Yamada等从宽叶菜豆中提取分离出2种α-淀粉酶克制剂,这两种克制剂对害虫体内α-淀粉酶都有克制作用,但体现不同的特异性。米切尔·什科普等运用超临界CO2提取技术,从豆类物质中提取和纯化了α-淀粉酶克制剂[5]。2.12麦类植物王转花等研究了甜荞和苦荞这2种荞麦中的α-淀粉酶克制剂。先用水浸泡荞麦3h,再用丙酮脱脂,对脱脂后的荞麦粉用pH6.8的磷酸盐缓冲液水浴提取3h,离心分离,上清液在磷酸盐缓冲液中透析,得到活性不不大于0.037u/mg的α-淀粉酶克制剂[6]。张万山等将小麦和水以1∶4的比例混合浸提,离心分离出上清液,通过硫酸铵盐析、水浴加热灭酶、离心分离和醋酸钠溶液透析制得粗品,通过柱层析纯化,获得比活为921.7u/mg的高纯度α-淀粉酶克制剂[7]。Franco等将BR35小麦磨碎后,用固液比为1∶5的NaCl溶液提取小麦粉,并经高速离心、硫酸铵沉淀、反相高效液相洗脱层析,得到α-淀粉酶克制剂的成品[8]。Miyazaki等提出了用弱酸弱碱、水和醇溶液对小麦粉和蛋白粉进行解决,提取α-淀粉酶克制剂的工艺[8]。加工过程中用多聚糖对初提上清液进行沉淀,随即用金属离子除去多聚糖,再用离子交换柱脱除金属离子,得到高克制活性的α-淀粉酶克制剂。2.13齿苋类植物王琳等从野生苋属植物（Amaranthuspaniculatus）籽实中分离纯化出α-淀粉酶的一种新型蛋白质类克制剂，是现在报道的α-淀粉酶的蛋白质类克制剂中相对分子质量最小的。初步分析成果表明，这种克制剂由9个氨基酸残基构成，其N端为焦谷氨酸。在弱酸性条件，下它能以非竞争性克制作用方式有效克制美洲蜚蠊消化道α-淀粉酶的活性，但对人唾液淀粉酶活性无影响。2.14其它植物高小平等对126种经水煮、醇沉提取的惯用中药进行α-葡萄糖苷酶克制剂活性筛选,在0.1mg/mL反映体系下,5种中药提取物克制α-淀粉酶活性[9]。张冬英等对普洱茶中α-淀粉酶克制剂的提取工艺进行了研究。通过正交实验办法拟定普洱茶中α-淀粉酶克制剂的最佳提取工艺条件为:浸提时间为3h,固液比为1:5,乙醇浓度为90%[10]。王琳等从野生苋属植物籽实中分离纯化出了α-淀粉酶的一种新型蛋白质类克制剂,初步分析成果表明,这种克制剂有9个氨基酸残基构成,其N端为焦谷氨酸。2.2来源于微生物的α-淀粉酶克制剂国外对于微生物α-淀粉酶克制剂的研究开展得较早1970年Niwa等报道在一种链霉菌培养液中发现了能够克制α-淀粉酶克制剂诺吉利霉素。日本Narimasa报道了由真菌CladosporiumherbarumF-28产生的蛋白类克制剂,打破了传统认为只有放线菌才干产生克制剂的观点[8],并且此种酶克制剂对哺乳动物α-淀粉酶有极高的特异性。Namiki等报道从一株链霉菌发酵液中分离出一种新的寡糖类α-糖苷类水解酶克制剂Adiposin[11],体内实验对胰腺或唾液的α-淀粉酶有很强的克制作用,并能减少血糖和血脂的浓度。Tajiri等报道从链霉菌属中产生的α-淀粉酶克制剂含有14种肽,某些是含N碳水化合物,另某些是由单个多肽链构成的分子量为3926～8500Da之间的聚合肽[11]。国内酶克制剂方面的研究始于70年代末。福建省微生物研究所从土壤中筛选出产生酶克制剂的产生菌S-2-35菌株,并对其代谢产物的分离及其理化性质进行进一步研究,成果明显。上海医药工业研究所也与日本和美国的多家公司及研究机构共同研究,建立了淀粉酶克制剂等筛选模型[8]。河北省科学院生物研究所从链霉菌中获得产生α-淀粉酶克制剂的菌种S-19-1,系国内首先从淡紫灰类群中筛选出该克制剂菌株,建立了适合S-19-1菌株的发酵工艺。王欣荣等采用α-淀粉酶及蔗糖酶克制实验,从株放线菌发酵液中筛选α-葡萄糖苷酶克制剂,成果从淡紫灰链霉菌HW110(StreptomyceslavedulaeHW110)发酵液中分离到HW110,其抑酶活性与阿卡波糖(Acarbose)相称[12]。3α-淀粉酶克制剂的分离纯化α-淀粉酶克制剂的来源不同，其分离纯化的办法也有所不同。从植物源获得的α-淀粉酶掏剂分离纯化办法，据Ho等报道，重要环节涉及磨碎、热解决或用水浸提、用硫酸铵沉淀或乙醇分离、过EDTA-cellulose柱层析、SephadexG-75柱凝胶层析以及CM-cellulose柱层析后分离，冻干得白色粉末状酶。从微生物来源获得的α-淀粉酶制剂的分离纯化办法，据Jajiki报道，重要环节是将发酵液过滤除去不溶物，清液中加活性炭，活性炭吸附后，用乙醇洗脱，经多次柱层柱和纸层柱，再经SephadexG-15柱凝胶过滤，再经HPCL得单个活力峰，收集活力峰，冻干得白色粉末状酶。4α-淀粉酶克制剂的检测办法现在，对于α-淀粉酶克制剂的检测项目重要涉及活性、含量纯度及相对分子质量文。献显示，α-淀粉酶克制剂普通都为蛋白质类物质，其含量、纯度和相对分子质量都可根据蛋白质的测定办法进行。而克制活性的测定办法重要涉及碘比色法和3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法(Bernfeld法)2种[11]。4.1碘比色法测定过程在试管中进行。取0.25mL浓度为1mg/mL用磷酸盐缓冲液配制的α-淀粉酶，加入0.25mL待测液，37℃结合30min。加入1％可溶性淀粉溶液1mL、37℃恒温反映15min后加碘显色，于660nm处测定吸光度值。空白管不加淀粉酶和克制剂，对照管不加克制剂。根据吸光度的差别计算克制剂的相对活度。4.23,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法取适量用0.12mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.10）制备的α-淀粉酶储藏液，加入100μL浓度为10g/L的可溶性淀粉，37℃反映5min。反映完毕后加入500μL3,5-DNS，沸水浴10min，取出反映液室温冷却15min，在546nm处测定吸光度值。调节克制剂溶液及α-淀粉酶溶液的浓度或用量，使A546nm的值在0.4～0.7范畴内为宜。程秀丽[13]根据α-淀粉酶活性的测定办法，将淀粉降解产物还原糖在特定条件（添加DNS）下比色，测定其含量，通过原则曲线计算出酶活性，求出α-淀粉酶克制剂的活性。此种办法可作为高通量筛选抗糖尿病药品的有效办法。α-淀粉酶克制剂是现在治疗糖尿病和减肥领域较为安全的一类药品。它广泛分布在许多天然植物中，特别在麦类和豆类这些大宗粮食作物中含量较高。开发α-淀粉酶克制剂等产品，有助于激发农民种粮主动性，对增加农民收入故意义。5α-淀粉酶克制剂的筛选办法现在在α-淀粉酶克制剂的体外筛选实验中，α-淀粉酶的重要来源多为胰α-淀粉酶，胰α-淀粉有着来源不易、成本高等缺点。α-淀粉酶克制剂测定办法多采用3，5-二硝基水杨酸法，其测定原理：α-淀粉酶克制剂特异性地克制α-淀粉酶，减少α-淀粉酶对淀粉水解，使得淀粉降解产物减少，3，5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原的棕红色氨基化合物减少，在一定波长下吸光度值减少。通过对添加克制剂前后生产还原糖的量进行定量测定，可从前后变化测得α-淀粉酶克制剂的活性。在Bemfeld法测定α-淀粉酶活性中，规定调节克制剂及α-淀粉酶液浓度使得A值在0.4～0.7之间，范畴较窄，不利于比较不同克制剂活性及量效关系。6α-淀粉酶克制剂的研究进展6.1国内外研究概况国外α-淀粉酶克制剂研究起步较早，早在上世纪四十年代就有小麦种子中α-淀粉酶克制剂的报道。它是一种电迁移率为0.2，分子量为21000的蛋白质。但在随即的25年间极少有这方面的报道[8]。之后Shainkin和Birk[9]提出小麦粉中存在两种α-淀粉酶克制剂，并叙述了它们的分离和性质。它们的电迁移率不同，对不同来源的α-淀粉酶专一性不同。从后来的研究懂得：它们在小麦种子中是多分子形式的蛋白质，能不同程度的克制昆虫和哺乳动物的淀粉酶。1945又在普通大豆上有过报道，1972年α-淀粉酶克制剂曾经在微生物上有过报道，因其在医药上的价值而被广泛研究。α-淀粉酶克制剂在20世纪70年代被进一步研究，在20世纪80年代和90年代，由于发现其在医学上的重要性，特别在克制糖尿病和高血糖以及对昆虫选择性控制等方面含有重要作用而加速研究。70年代以来，已研究发现100多个来自植物和微生物的克制α-淀粉酶的活性物质，有的已经进入临床实验。微生物来源的糖苷水解酶克制剂的筛选研究在近些年来已成为比较活跃的领域之一，特别在联邦德国和日本。现已报道的这类酶克制剂20~30种。Namiki等报道从一株链霉菌发酵液中分理出一种新的寡糖类α-糖苷水解酶克制剂Adiposin。体内实验Trestatins对胰腺或唾液的α-淀粉酶有很强的克制作用，并能减少血糖和血脂的浓度，是一种新的α-淀粉酶克制剂[2]。国内酶克制剂方面的研究始于70年代末，福建省微生物所从土壤中筛选到产生的淀粉酶克制剂的产生菌S-2-35菌株，并对其代谢产物的分离及其理化性质进行进一步研究，研究成果明显[1]，上海医药工业研究所在80年代初就开始与日本东京微生物化学研究所，日本麒麟啤酒和美国辉瑞公司等合作从土壤中寻找新的有为生物产生的生理物质的研究，建立淀粉酶克制剂等的筛选模型[2]。国内研究突出得是河北科学院生物研究所从链霉菌中获得产生α-淀粉酶克制剂的菌种S-19-1，是国内初次从淡紫灰类群中筛选出该克制剂菌株，建立适合S-19-1菌株的发酵工艺，并对其化学性质进行研究。发酵滤液中的α-淀粉酶克制剂活性超出70%。经BALB小鼠实验，无任何毒副作用。该研究已获得中国科技成果奖。江西省中医药研究所从小麦中提取一种α-淀粉酶克制剂，并对其理化性质及构造构成作了进一步研究。现在，建立在分子生物学基础上的植物基因工程技术，研究得较多的抗虫基因是α-淀粉酶克制剂基因，α-淀粉酶克制剂在禾谷类和豆科作物的种子中含量较为丰富。它的杀虫机理就在于其能克制昆虫消化道内淀粉酶的活性，使食入的淀粉不能消化水解，阻断了重要能量来源，同时，α-AI和淀粉消化酶结合形成EI复合物，也会