固定化酵母发酵啤酒性能研究

固定化酵母发酵啤酒性能研究

细胞固定化技术是利用物理或化学手段将游离微生物（细胞）或酶固定在有限的空间区域，以保持其活性并重复使用的技术。这是过去十年生物工程中的一个重要研究领域之一。海藻酸钠是一类天然高分子多糖,对微生物无毒害作用,传质性能较好,是包埋中常用的载体。传统的啤酒发酵工艺,采用游离细胞发酵,啤酒发酵速率慢,发酵时间长,设备利用率不高。而固定化细胞发酵是利用高度密集的细胞生物量来加快发酵速度,达到缩短发酵周期,提高生产效率的目的,且固定化细胞可以反复使用,大量节约培养酵母菌种的设备和原料,大大减少酵母增殖的时间,提高了发酵强度。本文利用海藻酸钠固定化酵母细胞,通过测定发酵过程还原糖和双乙酰等的变化,比较游离细胞与固定化细胞发酵过程,并对固定化酵母进行批次发酵研究。以期为啤酒生产企业技术改造、提高生产效率提供技术基础。1材料和方法1.1实验材料1.1.1海藻酸钠cpCaCl2(AR),NaOH(AR),海藻酸钠(CP),邻苯二胺(CP);葡萄糖(AR)、3,5-二硝基水杨酸(CP)、酒石酸钾钠(AR);麦芽:中粮麦芽江阴有限公司。1.1.2超净工作台设备HH-6型电热恒温水浴锅、B250生化培养箱:金坛市杰瑞尔电器有限公司;SW-CJ-2FD型双人单面超净工作台:苏州净化设备有限公司;722型分光光度计、PHSJ-5型实验室pH计:上海精密科学仪器有限公司;DSX-280B型高压蒸汽灭菌锅:上海申安医疗器械厂:SP-2100UV型紫外分光光度计:上海光谱仪器有限公司。1.1.3病毒1.2实验方法1.2.1糖化酶操作麦芽粉投入50℃水中(麦芽粉与水的比1:4)→50℃保温1h→升温至68℃加入糖化酶→保温糖化60min→升温至100℃→100℃煮醪30min→过滤→滤液用水稀释至11.5~12.5oBé(波美度),分装于三角瓶,121℃灭菌20min。1.2.2酵母菌悬液的制备挑取于麦芽汁斜面活化的酵母菌菌种于100mL麦芽汁中,30℃培养24h,4000r/min离心10min,倾去上清液,沉淀用无菌水震荡洗涤重复离心1次,用无菌生理盐水将酵母制成菌悬液,备用。1.2.3母细胞的固定化1.2.3.酵母菌种的制备配制2.5%海藻酸钠分装于100mL三角瓶中(30mL/瓶),121℃维持20min灭菌,冷却至室温,加入3mL酵母菌悬液,混匀,用简易的自动装置滴加到100mL灭菌的2%CaCl2溶液中形成圆形颗粒,室温固化3h,转入4℃冰箱过夜,用无菌生理盐水洗涤3次,备用。1.2.3.2.固定化细胞凝胶直径的测量1.2.3.3固定化化机械强度的测量取20个均匀的固定化颗粒,用50g砝码加压2min,然后用直尺测量总长,重复3次,计算平均值。1.2.4芽汁还原糖、双乙酰、酒精含量、酸度固定化酵母倾去生理盐水,加入250mL麦芽汁,15℃发酵,每隔12h取样,分析还原糖、双乙酰、酒精含量、酸度等。每次试验3个重复(本文啤酒发酵的主发酵都在15℃下进行)。1.2.5游离脂肪酸的发酵实验1.3酒精双乙酰含量的测定还原糖的测定:DNS法;酒精度的测定:蒸馏法(换算成温度20℃时用体积分数表示的酒精浓度/%);双乙酰的测定:分光光度法,双乙酰含量(mg/L)=A335nm×2.4式中:A335nm为式样在波长335nm下用10mm石英皿测定的吸光度;2.4为吸光度与双乙酰含量换算系数。2结果与分析2.1自动化制备凝胶珠固定化细胞珠的制备传统方法是用注射器将海藻酸钠与细胞的混合物注入氯化钙溶液中,该方法能制备直径较小的小球,但如果制备量大,劳动强度大,手的用力难控制流速均匀,造成凝胶珠的大小不均。也有人研究固定化凝胶珠的自动化装备,如脉冲电场微球制备仪等,需要的设备多,给无菌操作带来麻烦。本实验室利用简易装置实现了凝胶珠的自动制备,方法是用乳胶管把玻璃漏斗和移液枪的枪头连接起来,用止水夹控制流速,灭菌后使用,可实现自动化制备凝胶珠。通过该方法能固定到直径2~3mm小球,用砝码加压不易破裂,另外将其在实验桌上用力摔打时很易弹起。固定化凝胶珠颗粒性质见表1。2.2酵母发酵啤酒生长特性的测定加入酵母菌悬液3mL于250mL麦芽汁,混匀,取样计数,细胞数为7.1×105cfu/mL,15℃培养,每隔12h取样计数,测定酵母发酵啤酒的生长曲线见图1,由图1可看出0~24h为延迟期,24~60h为对数生长期,60h后进入稳定期和衰亡期。2.3固定化细胞与游离细胞之间的主发酵过程2.3.1还原糖活性测定同一批麦芽汁分别接种游离酵母和固定化酵母,接种量相同,15℃发酵,每隔12h取样,过滤后测定还原糖,测定结果如图2所示,0~24h细胞处于延迟期,还原糖的降得较慢,24~60h对糖的消耗很快,且固定化酵母发酵比游离酵母发酵对还原糖的利用迅速。2.3.2生成双乙酰a已知在啤酒生产中形成双乙酰的途径可能有3个:(1)在酵母合成代谢过程中,当α-酮酸合成缬氨酸的时候,会产生一种必然的中间产物,称为α-乙酰乳酸,α-乙酰乳酸通过非酶分解即形成双乙酰。(2)乙酰辅酶A与羟乙基硫胺素的焦磷酸盐(又称活性乙醛)的直接缩合,进一步放出辅酶A而形成双乙酰。(3)污染了可以生成双乙酰的杂菌,主要是链球菌。由于双乙酰对酵母菌有毒害作用,酵母菌一般都具有还原双乙酰的能力(酵母细胞含有双乙酰还原酶),可以把双乙酰还原成丁二醇。在啤酒生产中通过测定双乙酰值可以看出啤酒是否成熟,双乙酰值低于0.10mg/L作为评价成熟与否的决定性指标,是啤酒界一致认同的。通过测定双乙酰值,还可以发现出发酵过程中的一些问题,如可能染菌等。15℃发酵,每隔12h取样,测定双乙酰结果如图3所示,由于0~24h细胞处于延迟期,双乙酰生成量小,24~60h细胞代谢旺盛,双乙酰大量生成,随着发酵进行,酵母逐渐将双乙酰还原,发酵液中的双乙酰值很快下降,从图3可看出,固定化酵母发酵对双乙酰的还原能力比游离酵母发酵强,发酵72h固定化酵母发酵啤酒中双乙酰降到0.16mg/L,而游离酵母发酵啤酒中双乙酰为0.33mg/L。2.3.3酒精含量测定从表2可看出,固定化酵母发酵啤酒过程总酸的变化较小,且酒精含量比游离细胞发酵高。综上所述,固定化酵母发酵啤酒比游离酵母发酵啤酒能更快地利用还原糖,还原双乙酰,酒精含量高,提高了发酵速率,可见固定化酵母发酵具有明显的优势。2.4固定化酵母发酵啤酒第2批将发酵一批后的固定化细胞用无菌生理盐水洗3次,加入250mL麦芽汁,进行下一批发酵,15℃发酵48h取样测定各参数。批次发酵实验结果如下表3所示。由于经过第1批发酵,固定化细胞珠中细胞得到有效扩增,使得随后的批次发酵到48h发酵液中还原糖降到1%以下,双乙酰值降到0.10mg/L以下、从还原糖和双乙酰的数据说明,进入第2批后固定化酵母发酵啤酒,48h主发酵已完成,发酵液透明清亮,具有啤酒香味。而传统的游离酵母啤酒发酵主发酵需7~10d,固定化细胞珠用无菌生理盐水洗涤后藏于4℃冰箱45d后再进行啤酒发酵实验,仍然有好的发酵作用。3固定化酵母发酵啤酒本实验利用简易装置实现了凝胶珠的自动制备,该方法能固定到直径2~3mm固定化小球。经机械强度测定和发酵性能测定固定化小球性能良好。固定化酵母与游离酵母发酵实验研究表明,固定化酵母发酵啤酒比游离酵母发酵啤酒能更快地利用还原糖,还原双乙酰,酒精含量高,可见固定化酵母发酵具有明显的优势。该工艺发酵啤酒周期为一个星期,而传统的游离酵母发酵啤酒周期需20~30d,固定化酵母发酵啤酒由于发酵周期短,特别适合夏、秋季啤酒需求量大的季节啤酒生产厂家应用。啤酒酵母(Saccharomycescarlsber-gensis):本实验室