黄皮叶化学成分及抑菌活性研究

黄皮叶化学成分及抑菌活性研究

目前，国内外正在大力开发高效、低毒、广光谱、经济、节约控制的反腐倡廉剂。寻找植物中的细菌或细菌物质已成为发展天然防腐剂的重要手段。黄皮[Clausenalansium(Lour.)Skeels]属芸香科植物,黄皮子,原产我国南部,主要是分布在我国南方各省,尤以广东、广西、福建等省种植面积较大,是著名的“岭南佳果”之一,素有“果中之宝”之称。其果实富含糖分、有机酸、果胶、VC、挥发油、黄酮等,具有较高的营养价值和重要的药用价值。黄皮的叶、树皮、果肉等在中药上也有应用,黄皮叶苦、辛、性平,有解表散热、顺气化痰功能,主要用于流感、脑脊髓膜炎和疟疾等,可见它具有良好的药用价值,但对其开发利用,目前国内研究不多。因此,本研究以黄皮叶为原料,采用超声辅助有机溶剂法提取黄皮叶活性成分,研究黄皮叶不同溶剂提取物对几种常见食品病原菌的抗菌效果,同时对不同溶剂提取物的化学成分进行初步鉴定,以期为食品保鲜、天然防腐剂的开发和黄皮叶的综合利用提供基础研究资料。1材料和方法1.1材料和机器1.1.1材料表面黄皮叶:采自于广西桂林市郊区。1.1.2酵母菌种及酵母菌种金黄色葡萄球菌(Staphyloccusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、啤酒酵母(Saccharomgcescerevislac):广西师范大学生命科学学院发酵工程实验室提供。1.1.3热浴锅、水浴室和超净工作台KQ-500DE型数控超声波清洗器;UV-1201紫外可见分光光度计;HWS26型电热恒温水浴锅;VTX-3500型旋涡混合器;YXQ手提压力蒸汽灭菌锅;HP400S生化培养箱;SW-CY-ZF超净工作台;RE-52A旋转蒸发仪;FW-80型万能粉碎机等。1.1.4氯化铝及三氯化铁、碘、碱、三氯化铁、碘、硫酸、硫酸盐的含量乙醇、石油醚、硝酸铋、氯化汞、碘化钾、镁粉、三氯化铝、氢氧化钠、三氯化铁、溴酚蓝、碘、盐酸、浓氨水、磷钼酸、浓硫酸、氯仿等(均为分析纯)。1.2方法1.2.1黄皮叶粗提物的制备黄皮叶洗净,55℃烘干、粉碎过40目筛。取10g分别采用石油醚、乙醇、水为提取溶剂,在料液比(g∶mL)为1∶15、超声频率40kHz、超声波功率200W、提取时间20min条件下提取两次,合并两次提取液减压浓缩成浸膏,分别得黄皮叶石油醚、乙醇、水粗提物,0℃~4℃下保藏备用。1.2.2供试菌的制备酵母膏琼脂培养基配方:蛋白胨10g、麦芽糖20g、酵母膏5g、琼脂20g,将各原料溶化后补水至1000mL,pH自然,灭菌供活化各供试菌用。1.2.3供试菌液的制备为使结果准确,接种菌量必须标准化,采用麦氏浊度法测量菌浓。供试菌斜面活化、培养,然后将试验菌用生理盐水配制成梯度菌液,以麦氏0.5号标准管为对照,在560nm处用分光光度计测各梯度菌液的吸光值,挑选0.5麦氏浊度的稀释菌液,即相当于各供试菌的浓度为1.5×108个/mL,备用。麦氏0.5号标准管的配制:配制0.048mol/L的BaCl2(即150g/mL的BaCl20.5mL加0.18mmol/L的H2SO499.5mL配制而成),置于避光处保存。1.2.4无菌试验方法1.2.4.抑菌圈直径测定采用纸片扩散法对1.2.1各提取原液进行抑菌作用的预试验,用游标卡尺测量抑菌圈直径,抑菌圈最大的为抑菌最强的,结果取3次重复试验的平均值。选择该提取液进行进一步的定性、定量抑菌试验及化学成分的预试验。1.2.4.平板制备将灭菌冷却至45℃~48℃的培养基,每50mL加1mL1.2.3制备的试验菌液,混合均匀,取20mL置于培养皿中,制成含菌平板。然后将直径5mm的灭菌滤纸片放入不同浓度(原液、以及用20%乙醇稀释至浓度为50%、25%、12.5%、6.25%)的提取液中浸泡24h风干后均匀放置在培养基表面,轻压使之固定,每菌重复3次,并用20%乙醇作对照,分别放在合适温度下培养(细菌36℃培养18h~24h,真菌27℃培养24h~48h)。用刻度尺测定各平板上抑菌圈直径,结果取3次重复试验的平均值。1.2.4.供试平板的制备取黄皮叶提取物8g,用20mL丙酮溶解,用无菌水定容至100mL,此浓度为80g/L,采取2倍稀释法再分别稀释为40、20、10、5g/L不同浓度的供试溶液。吸取各稀释液2mL分别放入无菌的空白培养皿中,每皿中再加入18mL已融化的固体培养基,制成含各浓度提取物的供试平板。取0.2mL0.5麦氏浊度的菌悬液涂布在平板上,每种试验菌每个浓度重复3次(结果为其平均值),同时用含2%丙酮的平板作对照于28℃恒温培养24h,以不长菌的提取液的最低浓度为最小抑菌浓度(MIC)。1.2.5初步鉴定阶段采用化学成分预试验的方法对提取物化学成分进行初步鉴定。采用试管法对黄酮、酚类、有机酸、生物碱、甾体、萜类、挥发油、香豆素等成分进行定性鉴定。2结果与分析2.1抑菌活性测定采用纸片扩散法对石油醚、乙醇、水提取液进行抑菌作用预试验,结果见表1。表1结果显示,抑菌结果为乙醇提取物﹥石油醚提取物,而水提取物对几种试验菌抑菌作用不明显。表明抑菌活性物质为极性较大的醇提物和脂溶性物质,并且极性较大的醇提物的含量更高,抑菌活性更强。因此,选择乙醇提取物进行进一步的抑菌试验。2.2抑菌圈与抑菌效果的关系不同浓度黄皮叶乙醇提取物对供试菌的抑菌效果见图1、表2。表2、图1结果显示,不同稀释浓度提取物对4种试验菌的抑菌效果随着提取物浓度的降低而抑菌圈变小,两者呈一定的量效关系。并且,原液对几种供试菌都有显著的抑菌效果,其抑菌大小顺序为枯草芽孢杆菌>大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>酵母菌。其中原液对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最大,抑菌圈直径为15.5mm,且在提取物浓度为6.25%时仍对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用,表明它们对黄皮叶提取物敏感。2.3黄皮叶提取物的抑菌效果培养24h时,不同浓度黄皮叶乙醇提取物对试验菌的抑制效果见表3、图2。表3、图2结果表明,培养24h时,对照2%丙酮作为助溶剂无抑菌作用,从而可排除它对试验结果的影响。而不同浓度的黄皮叶提取物对4种试验菌均有抑菌效果,其中在本试验范围内对各试验菌的最低抑制浓度(MIC)分别为:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均<4mg/mL、啤酒酵母<8mg/mL。表明黄皮叶提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有显著的抑菌效果,对啤酒酵母有较好的抑菌效果。2.4黄皮叶的化学成分用化学成分预试验的方法,对乙醇、石油醚提取物进行化学成分定性鉴定,结果见表4。表4结果显示黄皮叶中含有多种化学成分,其中乙醇提取物中含有较多的生物碱、有机酸和香豆素,黄酮和酚类较少,表明乙醇提取物起抑菌的物质为生物碱和有机酸等。石油醚提取物中主要含有挥发油、甾体和萜类等物质。3抑菌活性试验结果1)石油醚、乙醇和水提物抑菌预试验结果表明,乙醇提取物的抑菌作用最好,表明黄皮叶抑菌活性物质是具有相当极性的一些化合物。2)抑菌试验结果表明,黄皮叶提取物对4种试验菌的抑菌效果随提取物浓度的降低而抑菌圈变小,两者呈一定的量效关系。其抑菌大小顺序为枯草芽孢杆菌>大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>酵母菌。其中原液对枯草芽孢杆菌的最大抑菌圈直径为15.5mm。各试验菌的MIC分别为:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均<4mg/mL,啤酒酵母<8mg/mL。表明黄皮叶提取物对前三者均有显著的抑菌效果,对后者有较好的抑菌效果。3)黄皮叶乙醇提取物化学成分预试验结果表明,黄皮叶中含有较多的生物碱、有机酸、香豆素、黄酮和酚类等物质,表明抑菌物质可能是生物碱、有机酸、黄酮和酚类等。石油醚提取物中含有挥发油、甾体和萜类等物质