一测多评法在中药多成分同步质量控制中的应用

一测多评法在中药多成分同步质量控制中的应用

中药多成分、多作用的特点是，单一成分难以证明中药的品质。多成分同步质量控制模式是建立并迅速普及的。另一方面，高参考水平和多指标质量控制的实际应用受到限制。那么,能否找到一种方法既能实现多成分的质量控制,又能克服对照品紧缺和检测成本高的困难呢?本着“发挥科研为标准服务,标准为生产实际服务”的指导思想,考虑到中药有效成分多为类群、类群间存在某些内在关系的特性,发挥科研工作者拥有大量单体成分(对照品)的优势,探索同类成分间的相关关系,在严格的方法学和交叉验证的基础上,使未来的质量标准在只测定某个代表性成分(易得、廉价、有效),同时可计算出其它待测有效成分的含量,使其计算值与实测值符合定量方法学的要求。我们把这种质量控制方法称为“一测多评”法(quantitativeanalysisofmulti-componentsbysinglemarker,QAMS)。该方法得到了《中国药典》2010年版一部的收录,为进一步规范QAMS的方法学考察、方法学验证等内容,制定本技术指南。1范围本方法适用于对照品难得或制备成本高或不稳定的情况下同类多成分同时测定。2相对校正因子及待测成分浓度的计算在一定的线性范围,成分的量(质量或浓度)与检测器响应成正比。在多指标(s,a,b,…,i,…)质量评价时,以药材(或成药)中某一典型有效成分作内参物(s),建立内参物与其它待测成分(a,b,…,i,…)间的相对校正因子(RCF,fsa,fsb,fsc,…),按下式计算:式中As为内参物对照品s峰面积,Cs为内参物对照品s浓度,Ai为某待测成分对照品i峰面积;Ci为某待测成分对照品i浓度。在方法学建立时,主要是求出内参物与各待测成分间的RCF,并把它作为一个常数用于含量测定中[药典附录VID3(3)]。在测定含量时,内参物(s)的浓度可按常规方法进行测定(Cs)(药典附录ⅥD);应用RCF(fsa,fsb,fsc,…),结合内参物(s)实测值Cs,计算待测成分(a,b,…,i,…)的浓度,见公式2。式中Ai为供试品中待测成分i的峰面积,Ci为供试品中待测成分i的浓度,As为供试品中内参物s的峰面积,Cs为供试品中内参物s的浓度,fsi为内参物s对待测成分i的校正因子。3重要内容和技术要求3.1测试指标的选择3.1.1对照品的确定原则上应选择药材中药理作用比较明确的有效成分或与药材临床功效具有相关性的指标性成分;作内参物的对照品(s)应是相对易得者;其他检测指标(a,b,…,i,…)应是不易得到或制备难度大或成本高或不稳定者。3.1.2质控指标验证在3.1中选择的待测成分,有时可能只是文献数据,能否作为QAMS质控指标,需进行实际验证。因此,在确定了多成分同时测定的色谱条件后,应对收集的样品进行初步分析,重点关注分析条件和各拟测成分峰面积范围等信息。3.1.3测量对象的成分含量3.2样品的标准规范选择有代表性药材作为研究样本,样本数应满足统计学的相关要求,原则上拟建立质量标准的药材样品不低于40批。药材应包括主产地、道地产区、GAP基地的药材和饮片样本。3.3必要时体制实验中所用的自制对照品需经严格的纯度检查,纯度应大于98%,必要时注明含量,供校正用。配制内参物对照品溶液:分别取各待测成分对照品(s,a,b,…,i,…)一定量,精密称定,采用适宜的溶剂,制成含适宜浓度的混合溶液,用于RCF的计算。3.4hplc分析条件的确定参照(药典附录ⅥD)的要求,完成色谱条件的优化。3.5方法研究3.5.1同时测定不同的组件参照药典附录ⅩⅧA的要求完成准确度、精密度、专属性、定量限、检测限、线性、范围、耐用性等各项内容的考察,应符合要求。3.5.2rcf影响因素的确定QAMS法的重点在于测定各待测成分(s,a,b,…,i,…)间的RCF,并对其耐用性进行系统考察。利用对照品溶液和确定的分析条件,建立内参物(s)与待测成分(a,b,…,i,…)之间的RCF(fsa,fsb,fsi,…)。待测成分RCF耐用性系指在测定条件有小的变动时,RCF对影响的承受程度。为使所建立的各待测成分的RCF能用于常规检验,应对待测成分RCF耐用性进行全面的考察,如果测试条件要求苛刻,则应加以限定。考察内容包括:RCF在各种条件(流动相的组成比例、pH值、柱温、流速及检测波长等的微小改变时和使用不同仪器、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、不同实验室、不同操作人员等)的耐用性。对于RCF值影响大的因素应具体分析后加以限定,以确保方法有效。要求:HPLC色谱仪、常用色谱柱、实验室、操作人均应≥3。若某因素使RCF产生较大偏离时(如小于或大于RCF平均值的5%),应增加考察数量,经考察仍大于5%,应对该因素进行规定,并列入该品种的标准正文中。经系统考察后,综合考虑影响RCF的各种影响因素,在RSD小于5%的情况下,取3.5.2项下的平均值作为RCF值;大于5%时,应对RCF影响大的因素进行限定。3.6已选中3.6.1药材中s,a,b,哌含量测定按照3.5.1项下建立的多成分同时测定方法,以各待测成分(s,a,b,…,i,…)为指标,以常规的方法(如外标一点法或两点法)测定它们在药材中的含量。数据要求:测定样品应≥30批,以尽可能反映各成分的实际分布情况。3.6.2s含量的计算对3.6.1项下各样品实测数据,以成分s为参照物,利用3.5.2项下的RCF值,按照公式2计算,求出其他待测成分(a,b,…,i,…)的含量。3.6.3数据比较对实测值和计算值进行分析比较(如相对偏差、t检验、准确度等),以验证QAMS法的合理性和可行性。3.6.4aams法的可行性、可重复性验证用所建立的QAMS法进行未测样品的实际测算,得到待测成分的含量;然后再以多成分同时测定方法进行反证,进一步验证QAMS法的可行性和可重复性。数据要求:验证样品应≥10批。3.7纳入标准和排除条件为了方便标准的使用,应对合乎3.5.2项下的RCF在纳入标准时做出规定:以样品含量的计算值与实测值间相对偏差小于5%为考量尺度,尽可能少地保留RCF的有效数字。3.8保留时间差的确定色谱峰的准确定位是保证QAMS法应用的前提,一般可以采用保留时间差或相对保留值等参数结合色谱图整体特征,以及每个峰的紫外吸收特征来定位其余待测成分(a,b,…,i,…)色谱峰。相对保留值指各待测成分与内参物s间保留时间的比值,计算公式:ras=tRa/tRs;保留时间差指各待测成分与内参物s间保留时间的差值,计算公式:ΔtRas=tRa-tRs。在3.5.2项下,应分别考察相对保留值或保留时间差2种参数在不同品牌仪器和不同规格色谱柱中的重现性,选取RSD值小的一种参数作为峰定位依据。RSD<5%时,符合要求;