单克隆抗体糖基化修饰研究

根据单克隆抗体的作用机制，其糖基化的位点、糖型种类及丰度都可能影响产品的有效性、安全性和质量稳定性，因此糖基化被普遍认为是单抗药物的关键质量属性（CQA）之一。多数单抗产品的生产宿主细胞为哺乳动物细胞表达体系，由于生产工艺控制的程度不同，糖基化水平在不同厂家、不同批次之间经常存在差异，给这类产品的研发和审评带来了较大挑战。研发单位应当在单抗产品早期研发阶段高度重视和设计规划糖基化修饰，建立相关检测方法，并在工艺变更和优化研究时密切关注糖基化及修饰水平；在产品临床阶段检测积累多批次糖基化检测数据，并在上市申报阶段制订合理、适用的控制标准；产品上市后开展对糖基化水平密切监测，以保证单抗产品质量持续稳定。鉴于糖基化修饰在单抗产品中的重要性，近年来工业界和研究机构对其结构、功能、工艺和质量控制进行了大量深入的研究，本文主要对这些研究进展作一综述。Part1、单克隆抗体的糖基化位点和结构

单克隆抗体糖基化修饰多数为N-连接的聚糖。IgG型单克隆抗体一般在Fc段的Asn-297有一个保守的N糖基化位点，另外约20%的IgG在Fab区域存在另一个N-连接的糖基化位点，这两个糖基化位点都位于重链上。研究发现，单克隆抗体两条重链的糖基化程度多数情况下并不对称，进一步增加了糖基化抗体的多样性。除N-连接的糖基化外，极少数单克隆抗体药物中也存在O-连接的糖基化。Fc聚糖分子的核心结构是由3个甘露糖（Man）和2个N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）分子组成的复杂“双触角型”五糖分子的结构，并且不同的糖型可含有不同数量的其他分子，如岩藻糖（Fuc）、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖（Gal）、二等分N-乙酰葡糖胺和唾液酸（Sia）。糖链的长度、分叉的方式、单糖的排列顺序的差异造成了N-聚糖复杂多变的结构。这种N-聚糖的核心结构可通过各种酶的作用进一步多样化，总结起来大致可分为三种结构，即高甘露糖型、杂合型和复合型，其中杂合型和复合型在大多数情况下均存在核心岩藻糖基化（图1）。抗体中常见的糖基化结构见图2。单克隆抗体上的N-聚糖结构对维持抗体构象和稳定性有重要的作用。Fc段的N-聚糖可以稳定IgG抗体的CH2结构域，去N-连接糖基化修饰的单克隆抗体热不稳定性加剧，其构象更容易展开和去折叠，更易于发生聚集。亦有报道去N-糖基化的IgG其CH2结构域弹性增加且不可结晶。NMR分析表明G2F糖基化的单克隆抗体其Fc段末端半乳糖暴露，易与受体蛋白结合，且1,3糖苷键和1,6糖苷键两个分支的结合能力存在差异。单抗Fc段N-聚糖可以通过CH2结构域影响抗原和单抗分子结合产生的效应功能，Fab段的糖基化修饰除了可能影响与抗原的结合外，也可能影响该效应功能。Part2、单克隆抗体的糖基化相关功能

单克隆抗体与抗原分子结合后可以引发效应功能，效应功能由Fc段介导，Fc与Fc受体或相关补体蛋白结合，可引发抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）或补体依赖的细胞毒作用（CDC）。单抗Fc段的糖基化水平可以影响ADCC和CDC，并能改变抗体的药代动力学性质，部分糖型结构还能影响抗体的免疫原性。1核心岩藻糖对抗体功能的影响

ADCC由Fc与Fc-γ受体（FcγR）结合后引发，其结合力明显受CH2结构域中N-聚糖影响，如降低/去除核心糖结构中的岩藻糖可以提高ADCC效应。研究发现由Lec13突变株表达的岩藻糖敲除的IgG抗体，其与FcγRIIIa结合能力提高了50倍，ADCC效应提高了100倍。抗体N-聚糖核心结构中的岩藻糖是由于蛋白通过高尔基体时，在α-1,6-岩藻糖转移酶的作用下从GDP-Fuc上转移岩藻糖基而得。采用敲除或低表达α-1,6-岩藻糖转移酶的工程细胞株，或其他途径降低IgG抗体中的核心岩藻糖水平，可以达到提高抗体ADCC效应的目的。

2半乳糖对抗体功能的影响末端半乳糖基对抗体效应功能的影响目前了解得相对较少。有研究表明CDC效应是由补体蛋白C1q与IgG抗体Fc段结合后引发，末端半乳糖含量增加可以提高CDC效应。采用糖苷酶处理去除半乳糖基可以减少补体的溶解活性。还有研究表明末端半乳糖化可诱导CH2结构域构象变化，导致其结合的FcγR增加；高半乳糖和去岩藻糖改造的抗体其ADCC活性较未改造前增加78倍。提高的半乳糖化可能导致Fc段CH2结构域之间空间距离增大，暴露出更多的氨基酸序列与FcγRⅢa结合。因此，综合以上研究基本表明末端半乳糖可以提高CDC效应，但目前CHO细胞表达的抗体其末端半乳糖化水平普遍较低，尚未有提高半乳糖化水平的工程细胞株报道。

3末端唾液酸对抗体功能的影响哺乳动物细胞表达蛋白的唾液酸修饰类型分为N-乙酰基神经氨酸（Neu5Ac，NANA）和N-羟乙基神经氨酸（Neu5Gc，NGNA）。人体内IgG的唾液酸类型为NANA，而NGNA型唾液酸主要存在于动物如小鼠体内。而采用哺乳动物细胞（如CHO细胞）表达制备的单克隆抗体，经常带有非人的唾液酸NGNA修饰。带有NGNA的单克隆抗体可能在人体中引发免疫原性。另外，唾液酸含量越高，IgG与Fc受体的亲和力越低，从而导致ADCC活性降低，且与细胞表面的抗原结合减弱，其原因可能是唾液酸所占较大的空间导致抗体铰链区弹性减小，从而降低了受体结合能力。有研究通过在表达IgG的宿主细胞中共分泌表达唾液酸酶A制备的非唾液酸化抗体，显示出更强的ADCC活性。

唾液酸化水平可能影响到蛋白药物的代谢。研究表明Fc融合蛋白的代谢受唾液酸化水平影响显著，融合蛋白中唾液酸NANA含量越高，体内清除速率越慢，且不受O-连接还是N-连接的影响，但NGNA类型唾液酸对蛋白的清除速率基本没有影响。4N-乙酰葡萄糖胺对抗体功能的影响研究表明末端N-乙酰葡糖胺基（GlcNAc）可以影响CH2结构域的热力学稳定性。去除GlcNAc后可以观察到明显的热不稳定性，同时对可溶性FcγRIIb的结合力略有降低。带有末端GlcNAc的IgG抗体具有更长的清除半衰期。带有并表达GnTIII基因的工程细胞株其表达的抗体的双触角结构中含二等分的GlcNAc，与FcγRIIIa结合能力提高，ADCC效应增强，10~20倍低浓度时即可显示杀伤效应，这也可能是由于空间位阻导致的核心1,6-岩藻糖暴露减少所致。5甘露糖对抗体功能的影响高甘露糖型对Fc聚糖的异质性程度影响较为显著，常见的末端甘露糖基团包括Man5GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2。研究表明高甘露糖型的单抗分子与C1q的亲和力较低，其CDC活性也较低；与FcγRIIIa亲和力则较高，相应的显示出了较强的ADCC活性，但也可能是核心岩藻糖缺失的缘故。高甘露糖型对单抗的药代动力学性质影响较大，大量文献报道高甘露糖型IgG分子在人血循环中具有较短的半衰期。FUT-8突变的CHO细胞生产的高甘露糖型和杂合型的IgG较复合型具有较高的清除速率。高甘露糖型结构在人体中容易引起免疫原性。酵母、昆虫细胞、植物来源的糖蛋白多为高甘露糖型，在人体中易引起高免疫原性。抗体中带有寡聚甘露糖的较无寡聚甘露糖的具有显著的免疫原性。虽然多数抗体药物中高甘露糖水平较低，但仍需密切关注产品可能引起免疫原性。细胞株和生产工艺的变化常伴随着甘露糖含量的变化。鉴于甘露糖型对单抗产品的活性、药代动力学性质、免疫原性都具有重要影响，末端甘露糖的糖型和含量一般应被视为单抗产品的关键质量属性（CQA）之一。Part3、生产工艺对单抗产品糖基化的影响

鉴于聚糖结构对抗体功能的重要影响，生产工艺中应严格控制糖型种类、比例和含量。细胞株、培养基、培养工艺都可能影响单抗产品的糖基化修饰水平。

1细胞株的影响

不同宿主细胞由于内质网和高尔基体中糖基转移酶和糖苷酶配置不同，其表达的单克隆抗体的糖基化修饰一般都存在差异。单抗生产常用的均为哺乳动物细胞，包括CHO、BHK、HEK293、PER.C6等细胞，以及鼠骨髓瘤细胞NS0、SP2/0、Y0等。CHO细胞是最常用的宿主细胞，主要是因为其基因组及扩增的稳定性较好，而且糖基化修饰稳定且类似于人的细胞系。但CHO细胞与人细胞系表达产物在唾液酸与半乳糖的连接方式方面有所不同，CHO细胞缺少α-2,6唾液酸转移酶，只能产生α-2,3连接的唾液酸化聚糖；人细胞系则有两种酶能产生α-2,3和α-2,6连接的两种唾液酸化聚糖，且以α-2,3连接的唾液酸化聚糖为主。缺少α-2,6连接的两种唾液酸化聚糖可能导致单抗分子体内具有不同的半衰期。另外CHO细胞缺少功能性的GnTIII酶，其可以阻断连接上二等分的GlcNAc残基。NS0细胞则由于可以添加α-1,3半乳糖和Neu5Gc而不是Neu5Ac，导致其表达产物在人体中引起较高的免疫原性。宿主细胞对单抗的质量有重要的影响，研发单位应该在立项开始即选择合适的宿主细胞，如在后期进行宿主细胞变更需要进行大量的试验对比研究。

2培养方式的影响细胞的培养方式可以影响糖基化的种类和水平。有研究表明，从分批培养变更为分批补料式培养，即使补料成分不变，糖基化修饰有明显不同。而培养方式不变，只是规模扩大，一般不会影响糖基化水平。因此，在单抗产品的开发过程中，培养方式应慎重变更，进行规模扩大时应注意关键工艺参数（CPP）的一致性。3培养基成分的影响

无血清培养基在单抗产品中已经得到广泛应用，然而与有血清培养相比，培养时间延长，更易造成糖基化的多样性和复杂性。培养基中的糖类等营养成分作为糖基化组成的结构片段或能量的来源，能够显著影响糖基化的异质性，分批补料培养方式可以在一定程度上保持糖含量的稳定，因此有利于糖基化水平的保持。有研究证明培养基中糖含量提高后，CHO等细胞表达的抗体分子中相应的糖基化修饰和唾液酸化水平均得到提高。低糖培养时，细胞将优先利用培养基中的糖满足能量需求，分配到糖基化修饰相应减少，分批补料培养基中去掉糖成分会导致了副产物的积累，减低了目标产物的糖基化水平。Mn2+是高尔基体中β-1,4-糖基转移酶的辅因子，无血清培养基中Mn2+与氨基酸成分的加入会造成更高的糖基化和唾液酸化。Mn2+自身并不足以造成最大程度的糖基化，必须与核糖类、半乳糖或尿苷类协同作用。另外有研究发现，当用半乳糖等其他糖类替代培养基中的葡萄糖，且Mn2+含量较高时容易造成高甘露糖型修饰。其他成分方面，丁酸钠可以通过阻断细胞周期特异地提高抗体的产量，但有报道培养基中加入丁酸钠可以减少半乳糖化和唾液酸化水平，增加抗体的电荷异质性。单糖在核糖存在时可以促进低聚糖天线形成，且核糖的存在对于糖型种类有重要影响。尿苷可以促进核糖合成，因此单糖、核糖、尿苷都可以影响产品的糖基化，进一步影响产品的质量。

4培养温度的影响

培养温度是影响细胞生长和产物质量的重要因素之一。应该明确的是，对细胞生长最适合的温度不一定适合重组蛋白生产。较低的培养温度（30~35℃）可以导致细胞周期阻滞在G0/G1期，具有最强的细胞活力和最低凋亡，表达产物的mRNA水平也较高。但较低温度时，细胞内的UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc降低，糖分支合成酶水平下降，可能造成未成熟的糖基化修饰结构出现。

5其他因素的影响

溶氧、pH值、游离氨、渗透压都可以影响抗体糖基化修饰的结构和水平。溶氧可能通过影响糖酵解途径或重链间二硫键的形成造成空间位阻进而影响到糖基化。氨或pH值可能通过影响细胞高尔基体内酶活性进而影响抗体糖基化修饰。渗透压常与培养基成分、pH值等因素联合影响糖基化水平。细胞培养中众多因素都可以影响糖基化修饰，往往单因素的变化会引起多因素的协同作用，基于数理统计模型的实验设计（DoE）已经用于研究细胞培养参数和原材料的变化对糖型结构的影响。在质量源于设计QbD理念下的生产过程更需要对糖基化进行实时监控，通过及时中止或调整异常糖基化的产品生产将可以使生物类似药等产品的工艺开发时间大大缩短，目前这类实时分析技术正在开发过程中。Part4、糖基化的检测技术

蛋白糖基化中的聚糖为非模板合成，结构非常复杂，因此，糖基化结构表征难度远超核酸和氨基酸序列表征，一般需要综合生物活性方法和理化分析方法，并借助质谱等现代分析仪器进行片段分析和鉴定。生物活性测定可以通过测定受体和靶蛋白的结合或测定受体/靶蛋白结合后的生物效应实现。如采用表面等离子体共振法测定抗体与其靶抗原的结合、各种Fc受体亚型的结合，基于作用机制开发的细胞内报告基因活性分析方法，细胞毒性测定方法，测定ADCC或CDC效应等。生物活性方法虽然灵敏度低于理化分析的仪器检测方法，但对于动物和人体试验有较大的参考价值。理化分析方法采用色谱、电泳、质谱等分析设备，一般具有比较高的灵敏度。根据测试样品分子量大小一般分三个水平进行，即完整抗体（top）和抗体亚单位（middle-up）、抗体片段（bottom-up）、游离寡糖。完整抗体和亚单位的水平分析中常见的技术包括RPLC-MS、CE/CIEF、MS（MALDI或ESI）、凝集素糖蛋白识别芯片等，一般均具有快速、方便、重现性好等优点，并不能提供糖基化修饰结构的精细信息，主要用于糖型结构的比较分析。抗体片段水平的分析通常用胰酶等蛋白酶对抗体进行酶解，产生分子量为0.5~5kD的小肽，采用色谱或电泳分离后再进行MALDI-MS或ESI-MS分析，可以提供氨基酸序列、糖基化结构和位点、微小的化学和酶修饰等信息。游离寡糖的分析通常采用酶法或化学试剂法使寡糖从完整蛋白中游离出来后，借助色谱-光谱（质谱）技术，可以对寡糖进行定性和定量分析。近年来，随着新材料和检测设备的开发，生物制品领域一些先进的分析技术逐渐涌现出来。亲水作用色谱（HILIC）采用大孔径、2μm以下的固定相使游离聚糖、糖肽和完整糖蛋白良好分离成为可能，再联合质谱的HILIC-MS技术可以获得不同糖型结构的定量信息，以便快速比较生物类似药与原研药的糖基化差异。二维（2D）色谱技术选用IEX、HILIC、RPLC、SEC、HIC中两种不同分离原理技术进行偶联，垂直方向上互补的分离技术结合在一起更易于鉴定一些未知的蛋白变异体。离子迁移色谱质谱（IM-MS）技术根据离子形状与电荷比实现分离，可以分离质量相同而形状不同的离子，其与质谱技术联用可为研究者提供更加丰富的结构信息，IM-MS技术已经证明在糖基化修饰结构、位点，尤其是同