微生物工程工艺与设备-微生物工程下游技术概述

微生物工程工艺与设备

——微生物工程下游技术概述

底物发酵罐检测控制仪表培养基（灭菌）经加工原料酶细胞生物催化剂（游离或固定化）机械能除菌空气产品提取纯化副产品产品废物热能原材料营养物典型发酵工业技术过程本部分解决的问题微生物工程下游技术的时代背景

①下游技术是生物产品工业化的必经之路

②下游技术是目前产品竞争力的关键技术

③下游技术经常是新产品开发能否工业化的关键因素。

④下游技术与环境保护密切相关。微生物工程下游技术概述

生物工程下游技术(DownstreamProcessing)，为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相关硬件设备的总称，微生物工程下游技术特指从发酵液中提取、分离纯化、富集生物产品的过程。下游技术的任务

发酵液目的产物原料伴随物，发酵副产物设备磨蚀物，添加剂低成本质量合格高收率微生物工程下游技术概述

1、下游技术的特点：物质分离

（1）非自发过程，需要能量（2）专有设备

（3）清洁生产

微生物工程下游技术的发展历程19世纪60年代前利用自然微生物来酿酒、制酱、醋、酸奶和干酪等疾病的预防我国古代的酿酒工艺利用牛痘预防天花不分离或简单分离微生物工程下游技术的发展历程19世纪60年代至20世纪40年代筛选和构建纯种微生物培养技术生产特殊产品。典型的例子发酵产乙醇、丙酮、丁醇1940年，丙酮和丁醇的产量分别超过了9000吨和4500吨有机溶剂蒸馏、精馏、过滤等技术生物工程下游技术的发展历程20世纪中叶（1940-1970）

无菌空气制备技术和液体深层耗氧发酵开发成功不仅有小分子，也有具生命活性的大分子典型产品：抗生素、酶、氨基酸。萃取、吸附、沉淀等技术微生物工程下游技术的发展历程20世纪70年代末

基因重组技术和细胞如何技术的进步第一个基因蛋白质———胰岛素大量高附加值产品吸引了大量投资。层析、电泳等技术微生物工程下游技术的发展历程

微滤、絮凝和连续过滤机等的新型固液分离技术与设备冷冻加压释放和酶、化学破碎等细胞破碎技术离子交换、双水相萃取、超滤等初步分离纯化技术。亲和层析和凝胶层析等高度分离纯化技术。酶色素细胞盐离子（水合）有机小分子小分子微生物工程下游技术难点多糖核酸发酵产物浓度较低，大多小于10%，悬浮液中大部分是水；酶的浓度经常小于千分之一，产品浓缩等环节能耗大，步骤多微生物工程下游技术难点生物制品的多样性而导致的生物分离方法的多样性。生物制品除糖类、脂类、蛋白质、氨基酸、核苷酸等以外，还有胰岛素、生长激素、干扰素等基因工程产品，另外，还有丁醇、丙二醇、甘油等小分子，产品的多样性导致分离方法的多样性。微生物工程下游技术难点悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；固体粒子可压缩性大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体；固液分离难度大离心、过滤难度大、效率低微生物工程下游技术难点整个分离过程要求条件温和，及时快速操作。欲分离的目的产物，通常不稳定，易失活。整个过程必须温度合适，pH合适，时间短，避免染菌。残留底物和产物共存，大量活细胞新陈代谢的生命活动还在进行，有可能引起产物的破坏和降解，导致发酵液的变质，给下游操作带来不必要的困难。微生物工程下游技术难点产品的质量要求高尤其是药品等。成品青霉素对其强致敏原---青霉噻唑蛋白必须控制RIA值（放射免疫测定）小于100（1.5*10-6），蛋白类药物（杂质<2%）、重组胰岛素（Humulin）中杂蛋白小于0.01%微生物工程下游技术难点绝大多数生物分离方法来源于化学品的分离方法成分简单成分复杂微生物工程下游技术现状分离纯化成本高、工艺复杂，过程精细。分离过程所占费用是产品的总成本的40～80%。基因工程的精细产品一般占到总成本的70～90%劳动力和物力成本占整个劳动力的70-90%。产品收率低。抗生素(80%左右)，蛋白质(60-90%)。比化工分离研发难度大，费用高。下游研究费用占整个R&D费用的50%以上原理技术应用Phasechange1)、蒸馏乙醇沸点和蒸汽压2)、精馏有机溶剂回收3)、蒸发制盐、抗生素富集Extraction1)、液-液萃取抗生素分配系数2)、液-固萃取中药分离

3)、固相萃取天然产物4)、双水相萃取酶

5)、反胶束萃取DNA重组蛋白质

6)、超临界萃取中药提取Densitydifference1)、常规离心细胞分离比重、密度2)、高速离心细胞、病毒分离3)、超速离心病毒,细胞器,DNA微生物分离工程的分类大约80%的化工分离方法应用于生物分离技术微生物分离工程的分类Membrane1）、常规过滤发酵液膜分离2）、微滤细菌、细胞碎片

3）、超滤蛋白质、酶4）、纳滤有机物回收,污水治理

5）、反渗透浓缩、污水处理Solubility1）、结晶味精溶解度2）、盐析蛋白质、酶3）、有机试剂蛋白质

4）、等电点法蛋白质、酶

微生物分离工程的分类Absorbance1）、非特异性吸附抗生素(吸附)2）、特异性吸附抗体3）、亲和吸附抗原抗体

4）、离子交换抗生素Chromatography1）、凝胶抗生素、蛋白质(色谱或层析)2）、亲和色谱抗体3）、离子交换蛋白质ElectricField1）、磁性免疫微球抗原抗体(场致分离)2）、区带电泳蛋白质3）、等速电泳蛋白类

4）、等点聚焦电泳蛋白类

发酵液成分复杂产物稳定性差

产品浓度低发酵液预处理加热调pH值细胞分离细胞破碎碎片分离初步分离精制产品絮凝离心过滤匀化超声研磨胞溶离心萃取膜过滤萃取吸附超滤沉淀分子筛离子亲和吸附电泳冷冻干燥胞外产物1）工艺复杂2）连续操作困难3）回收率低下游技术的一般工艺过程

具体的产品分离提取需考虑：（1）是胞内产物还是胞外产物；（2）原料中产物和主要杂质浓度；（3）产物和主要杂质的物理化学特性及差异；（4）产品用途和质量标准；（5）产品的市场价格；（6）废液的处理方法。下游技术的一般工艺过程

24工艺设计前应了解的信息

原料特性：(原料选择（粗、精)）粗料杂质多粗料发酵（酒精、柠檬酸、酶制剂等工业）—粗料中带入大量的不参与发酵过程的可溶性杂质和不溶性悬浮物—成本（下游技术）上升—分离提取困难、（环保）发酵废液处理成本高。清料（清液）发酵是发展方向。产品特性：小分子产品因分子结构简单，性质相对稳定，分离技术可选范围较大。产品性质限制下游技术的可选范围。如当生物技术产品是食品或药物时，从安全性考虑，溶媒的使用受到一定限制，如苯、或氯仿对人都是有害的。是否污染，分离介质、膜材料等方面都有一些限制。工艺设计前应了解的信息

产品特性(1)、溶解度及影响因素；(2)、分子量和分子形状；(3)、沸点和蒸汽压；(4)、极性大小；(5)、分子电荷及影响因素；(6)、功能团；(7)、免疫原性；(8)、稳定性及其影响因素；(9)、分子的淌度及影响因素；(10)、等电点pI。产品用途和质量标准

表1.3五肽胃泌素的上海市药品标准（1993年版32页）指标名称指标含量（C37H49N7O9S）97.0-103.0

比旋光度-25˚~-29˚

吸收值比A(280nm):A(288nm)=1.12-1.22

氨基酸各氨基酸之比为1

干燥失重，%0.5

产品的价格工艺设计前应了解的信息

4）、生产规模5）、危害性离心产生的气溶胶、发酵产的废气、干燥产生的粉尘等。目的产物本身的危害性；试剂危害。微生物的危害。6）、分批分离还是连续纯化工艺设计前应了解的信息

分离方法选择的基本原则1)、尽可能简单、低耗、高效、快速。2)、分离步骤尽可能少。

如φ5=0.955=0.77φ10=0.9510=0.63，

分离步骤多，设备投入大，人员物资消耗大，生产周期长

分离方法选择的基本原则3)、避免相同原理的分离技术多次重复出现

4)、尽量减少新化合物进入待分离的溶液。

A)、引起新的化学污染；B)、活性物质的变性失活

5)、合理的分离步骤次序。原则是：先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。

对环境的考虑1）、废水

A、除菌过滤和灭菌处理；

B、符合BOD的要求；2）、废料

A、灭菌处理；

B、综合利用：动物饲料、饲料添加剂，有机肥料3）、废气

A、除菌过滤和灭菌处理；

B、废气（有机溶剂）回收4）、溶剂的回收

A、减少环境排放，减少污染；

B、循环利用，减低成本

分离效率的评价1）、浓缩率

意义：1）、如mT

>1，则目标产物得到富积；2）、如mT

=mX，则目标产物未得到分离纯化。原料分离器产品废液

分离效率的评价2)分离因子