啤酒废酵母渣液中核糖核酸提取工艺的研究进展

啤酒废酵母渣液中核糖核酸提取工艺的研究进展

在啤酒废水的残渣中含有大量有机物质，将其排放到水中后会造成严重的污染和浪费。残余螺母渣中含有大量浪费，具有很高的回用价值。目前对啤酒废酵母渣液的回用研究,大多是对其中的蛋白质、核酸、维生素、微量元素和酶等,研究最多的是利用酵母的自溶,回收蛋白质和可溶性营养物。回用领域主要集中在提取生物制品、制备功能食品、环境保护、饲料、肥料、燃料、养殖等。啤酒废酵母渣液的回用不但减少环境污染,解决制约企业发展的难题,而且能提高啤酒生产原材料的利用率,提升啤酒产业的附加值,推动啤酒企业节约环保生产。1制备生物产品啤酒酵母由于含有多种氨基酸、核酸、葡萄糖、谷胱甘肽和其他生物活性物质,在生物制药行业中具有广阔的开发前景,其附加值最高。1.1啤酒废酵母提取的正交试验啤酒废酵母含有丰富的核糖核酸(RNA),主要分布在细胞质内,经过提取纯化的RNA及其降解产物核苷酸,在医药、食品、化妆品以及农业等领域具有重要用途,目前从啤酒酵母中提取RNA的技术方法有浓盐法、氨解法(碱法)及其二者联合法等。钟平等研究稀碱裂解法从啤酒糟中提取核糖核酸的,通过单因子和正交试验,获得了该工艺方法的最佳试验条件为NaOH0.2%,碱裂解煮沸时间25min,pH值为5.5,但该方法提取率和纯度较低。李珊等采用盐法提取啤酒废酵母RNA,最佳试验条件为酵母浓度8%,NaCl6%,抽提温度95℃,抽提时间6h,提取率提高为3.23%。可见,盐法优于碱法。孙荣丹等的研究也得出浓盐法优于稀碱法的结论。但王战勇等的研究提出了不同的观点,通过正交试验对浓盐法和稀碱法提取啤酒废酵母核糖核酸进行了比较。结果表明,浓盐法的适宜提取条件为NaCl(质量分数)15%、提取时间5h、提取温度90℃、酵母质量分数8%,核糖核酸的提取率为6.82%,纯度为85.45%;稀碱法的适宜提取条件为NaOH质量分数0.6%,提取时间50min,酵母(质量分数)10%,沉淀温度4℃,核糖核酸的提取率为12.14%,纯度为53.71%。浓盐法虽然提取率低于稀碱法,但产品纯度高,而稀碱法的提取时间短,更利于工业化生产。李艳等对盐法进行改进,与超声波技术结合,在酵母浓度3%,破壁时间为35min,破壁功率为90W,食盐加量为1.3%,可使核酸的提取率超过90%。何娟等采用盐法与碱法相结合破壁的方法,高温下提取核糖核酸,较传统工艺收率有显著提高,可达8.01%。最佳工艺条件为抽提温度100℃,W(NaCl)6%,抽提时间90min,pH8;并采用饱和酚/氯仿萃取—离心分离的方式去除蛋白质,纯度也有所提高。王晓丽等讨论了3种去除核糖核酸(RNA)中蛋白质的方法,研究发现添加40U/g绝干酵母中性蛋白酶降解蛋白质的方法为最好,蛋白质去除率为96.6%,RNA损失率最低,而其他方法在去除蛋白质的同时,RNA的损失也很严重,其中直接沉淀RNA的方法、饱和硫酸铵沉淀法RNA的损失率均超过50%。1.2啤酒废酵母发酵工艺啤酒废酵母残渣中含有大量的糖类,其中1,6-二磷酸果糖(FDP)和碱不溶性葡聚糖(β-葡聚糖)利用价值最高。碱不溶性葡聚糖具有抗肿瘤、抗辐射损伤、抗炎、降低血脂等功能,可作为免疫调节剂,是一种良好的生物反应调节剂。目前其制备方法主要有自溶法、碱法、酸-碱法、酶-碱法、结合法和超声波法等,前4种方法所得产品纯度较高,但酸碱用量大,对环境污染严重,工艺步骤多,成本较高,在一定程度上限制了酵母葡聚糖的应用研究。结合法是结合自溶、酶解和碱溶等方法优化碱不溶性葡聚糖的制备条件,结果表明啤酒废酵母采用1.0mol/L的NaOH碱溶处理7.5h效果最好,成品不含甘露聚糖,碱不溶性葡聚糖得率为9.59%,产品中蛋白质含量有所降低。超声波法是将酵母泥加适量的水,在超声波中处理一定时间,再离心洗涤,纯化干燥获得制品,该法工艺简便,成本低廉,收率较高,提取后的废液不含酸碱性物质,对环境的污染较酸-碱法要小,但其产品纯度不高,蛋白质含量也较高。1,6-二磷酸果糖(FDP)是啤酒废酵母重要生物药品之一,药理学已经证明,对休克、急性心肌梗塞、心肌缺血等症具有良好疗效,是临床上广泛应用的心血管特效药,目前国产FDP药物还不能满足国内市场的需要,仍然依靠进口。早在1974年Leisda等就报道了用啤酒废酵母,以蔗糖和无机磷为底物制备1,6-二磷酸果糖的研究。李祥等对啤酒废酵母生产1,6-二磷酸果糖发酵工艺进行了试验性探讨,发现发酵液中氯化镁的浓度、pH值是1,6-二磷酸果糖生产最主要的影响因素。最佳发酵参数为发酵温度37℃,葡萄糖浓度0.4mol/L,磷酸盐浓度0.4mol/L,pH值为6.5,有机溶剂的加量约6%。发酵液中1,6-二磷酸果糖的量最高为70.5mg/mL。朱玉强等研究也证明了发酵液中氯化镁的浓度、pH值是1,6-二磷酸果糖生产最主要的影响因素,与李祥研究的最佳发酵参数相近,1,6-二磷酸果糖在发酵液中的得率最高为69.8mg/mL。1.3啤酒废酵母添加谷胱甘肽谷胱甘肽是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的具有重要生理功能的活性三肽,又称为还原型谷胱甘肽(GSH),是生物体内主要的抗氧化剂,参与细胞内的多种反应,广泛用于医学、食品加工业、化妆品工业。其中发酵法是生产谷胱甘肽最具潜力的方法,而啤酒发酵工业产生了大量的废酵母,价格十分低廉,若能利用这些资源来生产谷胱甘肽,就有可能大幅度降低生产成本。通过好氧活化可以提高啤酒厂废酵母细胞内的谷胱甘肽含量,适当提高通气量和搅拌转速可以促进谷胱甘肽在酵母细胞中的积累,控制初始葡萄糖浓度在湿酵母加入量的10%左右,与专门培养酵母相比,本工艺的谷胱甘肽胞内含量约为其50%,但由于细胞浓度高,总产量提高了1～6倍,而且利用啤酒废酵母生产谷胱甘肽具有培养基无需灭菌和设备利用率高的优点,可以显著降低生产成本,使其成为生产谷胱甘肽的优质替代资源。邱雁临等对从啤酒废酵母中提取还原型谷胱甘肽进行了开拓性研究,首次提出以壳聚糖作为吸附剂,通过吸附层析法从啤酒废酵母泥为原料,经预处理和细胞破碎后得到的富含谷胱甘肽的抽提液中,分离纯化还原型谷胱甘肽。最佳提取条件为上柱啤酒废酵母抽提液的最适pH7.0,洗脱剂为pH4.4的磷酸盐缓冲液,还原型谷胱甘肽的平均洗脱率为84.18%,平均回收率79.55%。为了进一步提高谷胱甘肽(GSH)的提取率,又采用对羟基苯甲酸酯提取啤酒废酵母菌细胞中的谷胱甘肽(GSH)的研究。研究表明,按菌体与破壁液比例1∶2(v/v)加入0.5%的对羟基苯甲酸丙酯,30℃、pH5～6搅拌3h能有效地从啤酒废酵母中提取谷胱甘肽(GSH),溶液经离心后,上清液中谷胱甘肽(GSH)含量可达96.71mg/100mL。与现有的几种抽提方法比较,对羟基苯甲酸酯提取由于其提取含量高、不需要复杂和贵重的仪器、易于放大、经济性强而明显优于其他抽提方法。2复合营养的复合酱油的制备利用啤酒废酵母水解制得酵母抽提物来生产酱油、调味料、酸奶和蛋白粉等营养保健食品,是优化资源利用、保护环境、提高企业综合效益的有效途径之一,酵母抽提物的制备主要有2种方法:一是通过自溶;二是加酶降解,这2种方法各有优缺点。从得率看,前者得率约为70%,后者将近90%;从组成上看,外加酶法的酵母抽提物产品中呈味核苷酸含量高,而自溶法产品中的5’-核苷酸含量很低。这是因为酵母细胞本身含有核酸酶,能将核酸降解为3’-核苷酸,另外外加酶法制备的酵母抽提物成分中低分子糖类、肽类含量都比自溶法多,故产品风味更厚重。从这2点看,外加酶法更具有开发前景,因此,目前利用啤酒废酵母生产酱油均采用外加酶法。李魁等以燕麦和啤酒废弃生物质替代部分豆粕为原料,利用米曲霉和黑曲霉发酵酿造保健酱油,成品酱油质量符合国家二级酱油标准,吨成本比全豆粕酱油低210元。有人改用木瓜蛋白酶,同时利用固态低盐酿造工艺来生产生酱油,再经过适当的调配得到符合标准的优质酱油,木瓜蛋白酶改良废酵母自溶条件制备的酱油富含多种氨基酸、B族维生素,具有强烈的增鲜效应及醇厚浓郁的肉香味。刘振扬等改用溶茵酶促进酵母细胞自溶,再加入麦芽根内核酸酶分解REN生成呈味核苷酸的生产酱油,该法生产周期短、投资少、成本低;而且此法提取的酵母抽提物可以用作调味料。李大鹏用木瓜蛋白酶啤酒酵母自溶液15%,白砂糖添加量4%,柠檬酸为0.3%的最佳配方研制了啤酒酵母营养饮料,成品淡黄色,均一、透明、甜酸口感,有香鲜味。李彦利用啤酒厂废酵母为原料,通过脱苦、脱臭工艺及自溶,纳米对撞技术,提取可作为富含硒的高蛋白,并作为食品配料与牛奶按1∶2配方制作富含硒的啤酒酸奶。孙凌雪研究了利用废酵母生产酵母蛋白营养粉的工艺。借助啤酒废酵母的内源酶系,同时有目的添加部分外加酶(溶菌酶、核酸酶),将酵母菌体内高分子物质分解成小分子可溶性物质,包括游离氨基酸(20种)、核苷酸、多肽、糖分、B族维生素、麦角甾醇、有机酸、矿物质及降解后独特的芳香类物质。其中,氨基酸中的天门冬氨酸和谷氨酸具有鲜味,丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸等具有甜味,酵母抽提物具有增鲜增香作用,可赋予食品醇厚味的功能,并能掩盖食品中的异味,从而将独特的营养性与鲜味性融为一体,成为一种天然、营养型调味料。3啤酒酵母对废水中镉离子的生物吸附能力利用微生物菌体吸附水中重金属的方法,由于其价廉、节能和去除率高等优点而成为废水处理的研究热点。啤酒酵母外侧有0.1mm的2层细胞壁,内侧还有细胞荚膜,是金属离子主要积累的场所,其主要官能团包括-OH、-SH、-NH、-OP、C=O、P=O、S=O等,这些多糖中的氮、羧基、硫醇、醇、磷酸及其衍生物等与金属离子通过静电吸附、离子交换、络合和氧化还原等生物吸附机理,使溶液中的金属离子被吸附。周东琴等对啤酒酵母菌与水相中重金属离子Hg2+的生物吸附情况进行了研究,发现啤酒酵母对水相中的Hg2+具有良好地吸附效果,啤酒酵母菌对Hg2+的吸附是一个快速过程,在15min时吸附效果最佳,之后有解吸现象的存在。pH值对Hg2+的吸附影响很大,在pH3～5时吸附效果较好,温度对吸附效果影响不大。在pH3、吸附时间为15min时,对质量浓度为2.6g/L的Hg2+溶液进行吸附,去除率可达96%。有人研究了啤酒酵母对废水中镉离子的生物吸附过程,发现吸附过程快速,吸附能力较强,酵母的单位吸附量达46.5mg/g,特别适用于高浓度的含镉废水处理。镉吸附过程受pH值影响较大,最佳pH值为4～8,并且啤酒酵母有调节pH值的作用,pH值为4～8的溶液在吸附反应后,其pH值接近于5.8,温度、酵母用量、镉初始浓度对吸附也有一定的影响。游离酵母处理废水难于重复使用及连续操作,徐惠娟等研究用海藻酸钙凝胶包埋法对啤酒酵母细胞进行固定化,固定化后对Cd2+的吸附主要受到海藻酸钠浓度和Cd2+浓度的影响,合适的条件下,固定化之后对Cd2+的总吸附率仍能达到游离酵母的吸附水平,但要工业化应用还需要大量研究。王战勇等研究了啤酒废酵母对Pb2+和Cu2+的生物吸附能力。初步确定了对Pb2+的最佳吸附条件,起始pH值为5,Pb2+的起始质量浓度为50mg/L,酵母的质量浓度为1g/L,吸附温度为30℃,吸附时间为60min,吸附率达93.50%。解吸实验表明,浓度为1mol/L的HCI为较好的解吸剂,其解吸率可达54.59%。通过计算分析,啤酒废酵母对Pb2+的吸附符合Langmuir吸附模型和Freundlich吸附模型,且符合Langmuir吸附模型的程度更优。啤酒废酵母吸附Cu2+受吸附时间、吸附温度、溶液pH值、酵母添加量和Cu2+起始浓度等因素影响。pH值为4.0,Cu2+浓度为100mg/L,酵母添加量1.0g/L,吸附温度25℃,吸附时间2.5h,对Cu2+的吸附量为(91.82±0.54)mg/g(干酵母)。对未吸附Cu2+的空白酵母和吸附Cu2+的酵母进行红外光谱分析后认为羟基和羧基在生物吸附中起着重要作用。夏良树等将啤酒酵母菌与活性污泥曝气工艺结合,进行了处理含铀废水的研究。发现发酵工业的废菌丝体对废水中的铀酰离子具有良好的富集作用。投加10g/L啤酒酵母菌,处理100mg/L含铀废水,去除率可达78.2%;同时投加8g/L的活性污泥,使吸附效果显著提高,去除率上升到96.3%;并且处理后的溶液静置5min～10min,啤酒酵母菌随污泥自然沉降,出水澄清,不需离心分离。在低浓度时,啤酒酵母菌对铀的吸附能力很强;随着初始铀浓度的提高,铀的吸附量明显增加,但去除率却显著下降。啤酒酵母菌—活性污泥曝气处理不同初始浓度铀的吸附符合Langmuir和Freundlich吸附模型。张志强等以啤酒废水为培养基,利用其中的碳源和能源,对复合菌群进行发酵培养,制得微生物絮凝剂。将此絮凝剂处理靛蓝印染废水。研究了pH值、微生物絮凝剂用量和助凝剂(1%CaCl2溶液)用量对处理效果的影响,在最佳工艺条件下,微生物絮凝剂去除CODCr率79.2%、脱色率87.6%,其主要絮凝机理为吸附中和架桥作用。目前,利用啤酒废酵母渣液生物吸附处理污水的方法均处于实验室阶段,没有工业化的应用。4啤酒废水养殖的验证用啤酒发酵废渣加工饲料技术已经非常成熟,而该方法需要将啤酒发酵废渣液进行脱水,用干废渣加工饲料,脱水后排出的废液也含有大量的有机物,仍然会造成严重的污染;而且饲料产品附加值低,大多啤酒厂免费提供给加工企业,没有对发酵废渣液进行有效的回用。郑爱榕等利用啤酒废水养殖极大螺旋藻,经曝气处理的啤酒废水养殖的螺旋藻,相对生长率与CFFRI培养基的几乎一致,但蛋白质含量低于C