网络生物学在中药药理作用机制研究中的应用

网络生物学在中药药理作用机制研究中的应用

中医药是中华民族几千年来治疗病人和人类疾病的最重要形式和手段。结合不同的成分、不同的方法和不同的目标，它发挥了非药物的治疗效果，尤其是针对患有多环芳烃和其他慢性疾病的患者。进入21世纪以来,随着现代生命科学技术的发展,人类对疾病的生物学本质认识不断深化,医药界逐渐认识到多基因、多环境因素及其相互作用引起的复杂性疾病,仅用单一药物难以获得理想的治疗效果,也容易引起较大的毒副作用。此外,一系列成功的多药联用科研实践如鸡尾酒疗法抗HIV,进一步激发了西方医药界对复合用药的兴趣。在这一国际背景下,研究开发中药复方不仅对于继承和发扬祖国医药学,而且也最有可能使我国在复合药物研制上引领世界。然而,长期以来,中药复方化学成分纷繁复杂、组方配伍形式多样及功能主治的不确定性给复方研究带来了巨大挑战,难以用现代科学技术诠释中药复方作用的本质,中药复方的药理作用机制研究进展缓慢,阻碍了中医药在国际上的应用和推广,这一现状构成了中药现代化和国际化进程中主要的关键科学问题之一。近年出现的基于网络的分析方法为中药复方系统研究提供了有效的新思路新模式,本文介绍网络生物学方法的一些基本数学基础及其在中药药理作用机制中的可行性,并提出了研究的思路和技术方案。1网络聚集特征现实世界存在的大量复杂系统可以通过网络加以描述,典型的如邮政投递网络,电信宽带网络等。通常,一个代表性的网络是由许多节(顶)点(vertex)与连接2个节点的边(edge)组成。其中节点代表系统内不同的个体,边代表个体间的相互作用关系,即若2个节点以边相连,则其具有某种特定的关系,反之,则认为无相互作用。可以将上述文字表述用数学语言来表述,在图论中,通常将网络表示成一个无向图或有向图G(V,E)。其中,所有的个体构成节点集合V={P1,P2…Pn},个体间的相互作用构成了边的集合E={(Pi,Pj)|Pi和Pj之间存在相互作用}。节点间基本的相互关系可以用邻接矩阵来表达,对称的n×n阶邻接矩阵定义为A=(aij),其中:如上式,若2个节点相邻,则其在邻接矩阵中以“1”表示,否则以“0”代替。网络节点的度(K)、聚类系数(C)、紧密度(C)、平均路径长度(L)、网络直径(D)、介数(B)和拓扑系数(T)等参数是描述网络拓扑结构的重要指标;此外,度分布P(k)、聚类系数的度分布c(k)、最短路径分布SP(i)和拓扑系数分布TC(k)这4个参数也被广泛用于网络分析中。通过对这些指标的分析可以有效地获取生物作用网络的拓扑特点,并能够为研究相互作用网络的演化、生物功能、药物靶点发现、网络的稳定性和动力学特性提供独特的视角。下面基于无向图简要介绍这些重要的特征参数及其生物学意义。任意节点i的度Ki被定义为网络图中节点i连接的边数目,若以Nv表示系统节点的数目,则节点度和平均度可分别表示为:如在图1中,节点A,B,C,D,E的度分别为1,3,2,3,1。节点度是一种简单而又十分重要的拓扑特征,网络研究中,度值较大的节点称为中心节点(Hub),其值越大,表明该节点在整个网络中作用较关键。若用ni表示节点i的邻接节点集合中存在的连接总数,则聚类系数和平均聚类系数可分别表示为:在图1中,节点B与{A,C,D}相连接,这3个节点间只有C,D相连,所以节点B的聚集系数。同理C,D聚集系数也为1/3,而A,E相邻节点没有连接,所以其为0,因此平均聚集系数为1/5。聚集系数与平均聚类系数体现了部分节点间存在的连接密集程度,是对局部网络内聚性的一种描述,代表了一个节点与其邻接节点之间的相互连接性,反映了生物网络的层次特征。③紧密度(C)紧密度(closeness)是描述一个节点到网络中其他所有节点平均距离的指标,节点v的紧密度Cv定义如下:其中dij表示节点i到j的距离。图1中,节点B到节点{A,C,D,E}的最短距离分别是1,1,1,2,则节点B的紧密度为1.25。紧密度表示网络中心的接近程度,其值越小,表明网络中各节点越靠近网络中心,即网络聚集程度越大。④平均路径长度(L)平均路径长度L(length)是对网络中任意一对节点的最短路径长度求平均,描述了网络中分隔的任意2个节点所需的平均步数,可表示为:Np表示网络图中节点对的数目,lij是节点i和j之间的最短距离。图1中,平均路径长度L=1.6。网络直径是描述网络总体性质的一个参数,反映了网络聚集程度。⑤网络直径(D)网络直径(diameter)是任意一对顶点的最短路径长度的最大值,可表示为:图1中,以D,E间最短距离最大,因此D=3。网络直径反映了网络中节点连接可能出现的最远距离,是衡量网络紧密度的重要指标。⑥介数(B)一个节点的介数(betweeness)定义为网络所有的最短路径中经过该节点的数目,介数反映节点在特定网络拓扑结构中所处位置的枢纽程度,介数越大,表明该节点在保持网络紧密连接性中该节点越重要,可以用来有效地区别出网络模块,获取子网络。如图1所示,节点B的介数为3。通常介数较高的节点在生物网络中较重要,通常可以作为药物靶点或者重要的生化通路。⑦拓扑系数(T)拓扑系数(topologycoefficient)定义为相互连接节点间共享连接比例的测度,节点v的拓扑系数Tv可定义为:其中,Cv,i表示与节点v和节点i都连接的的节点数。Mv为所有与节点v分享邻接节点的集合。如图1所示,与B节点共享邻接节点共有3个(C,D,E),其节点度分别为2,3,1。则节点B的拓扑系数。拓扑系数反映了节点的邻接节点被其他节点连接在一起的比例。此外,度分布P(k)、聚类系数的度分布c(k)、最短路径分布SP(i)和拓扑系数分布TC(k)也反映网络的特征,通常用来区别随机网络(randomnetwork)、无标度网络(scale-freenetwork)和层次网络(hierarchicalnetwork)。一般说来,随机网络的特征是度分布服从泊松分布,平均集聚系数小,平均路径长度小;无标度网络的平均路径长度很小,与网络的规模成对数增长,网络的平均集聚系数远大于相同规模的随机网络的集聚系数,如邮政投递网络、交通运输调度网和万维网等;层次网络模型既具有高的集聚系数,同时度分布服从幂率分布。复杂生物网络的主要统计特征是小世界性、无标度性并且节点度服从幂律分布。2基于多种“组学”技术的研究用药2001年LeroyHood提出“系统生物学”概念——系统地研究遗传、化学、环境因素干预下生物体系的基因、蛋白和代谢物的变化,并通过生物信息学的数据整合,构建数学模型来认识和预测生命体的生物功能和生命活动,包括基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学。系统性、整体性是其主要特征,这与中医药理论强调的“整体辩证思维”不谋而合,因而系统生物学一经提出,就在中医药研究领域受到了广泛关注。近年来系统生物学在中药研究中的应用发展十分迅速,并取得了令人振奋的成果,陈竺、陈赛娟院士领导的团队采用蛋白质组学研究手段,较完美地诠释了中药复方黄黛片“君臣佐使”配伍规律,并在一定程度上揭示了其治疗急性早幼粒细胞性白血病多靶点协同作用的机制;贾伟教授领导的团队围绕肾、肝等组织,采用代谢组学方法,进行了中医病症的评价、中药复方干预的评价(药效和毒性)和中药药效物质基础等诸多方面的研究,显示了代谢组学在中医药研究方面重要的作用;基因组学(genomics)以基因芯片为核心技术,能针对中药的多成分、多靶点的作用特点进行全面深入地研究,罗国安教授等采用基因芯片技术获得了双龙方主要药效成分及其治疗心肌梗死过程所调控的功能基因网络。目前基于多种“组学”技术从整体上研究中药复方药效物质基础和药理作用特点获得了很大成功。然而,这种基于多种“组学”的高通量、高分辨率、高灵敏度技术多局限于表征药物干预前后生物系统的整体轮廓,而对于药物发挥作用的生物体系涉及的一些具体代谢、信号转导通路缺乏详细描述,更不能从“基因-蛋白-代谢”整体分子网络调控水平上探讨中药复方的作用机制。因而,现有的系统生物学方法仍难以阐明中药多组分、多途径、多靶点协同作用机制。3网络药理学在中医药理机制研究中的可行性3.1复杂生物系统单元系统生物学的研究表明,细胞的生物功能是基因、mRNA、蛋白及代谢物各个层次内部及层次间不同生命单元在不同水平上相互调节、相互作用的复杂过程。因此,迫切需要新的分析方法以处理生命单元间的复杂相互作用关系。复杂网络理论的迅速发展为在整体水平上研究生物网络的结构组成和功能提供了新的技术平台。2004年Barabási等提出“网络生物学”概念,其主要依赖图论、信息学及最优化方法等学科的方法来建立网络模型,将复杂生物系统单元(基因、mRNA、蛋白、代谢物)多层次复杂的相互作用形象地表达成网络图,通过分析网络的拓扑特征来获得对生物功能、疾病等生命活动更深入的了解。2005年Cell杂志首次刊登了人类的蛋白质相互作用网络;MarcVidal和DongsupKim等建立了药物与药物靶点蛋白相互作用网络,拓扑网络特征的分析显示绝大多数药物作用多个靶蛋白,反之亦然,为合理地进行药物发现指明了方向;Barabási等研究了人类疾病网络(humandiseasenetwork)及疾病的同病现象(comorbidity),他们整合KEGG,BiGG和OMIM等数据库相关数据,建立了人类疾病网络和代谢疾病网络(metabolicdiseasenetwork),发现复杂性疾病(如糖尿病)通常与其他的疾病有更多的关联(同病现象显著),作者认为Barabási的工作在某种程度上解释了“异病同证”和“同人同时患多病”的生物学基础;Ravasz等研究了代谢网络的层次组织特征,发现不同生物类别具有相似的网络特征;Goryanin等认为人类代谢网络(Humanmetabolicnetwork)的构建,不仅对于发现新的药靶,而且也为基于系统的药物设计提供了新的策略。上述的研究工作表明网络生物学是复杂生物系统间关系研究的有力工具,为人类认识复杂的生物功能、疾病过程等问题提供了一个全新的解决方案和视角。3.2药物靶点的构建通过网络生物学方法构建疾病生物网络(基因调控网络、转录调节网络、蛋白相互作用网络及代谢网络)来获取疾病的生物网络调节、药物靶点信息,为药物作用机制研究提供了新策略。Shipra等应用网络生物学方法识别了II型糖尿病一个重要的调节通路,并通过实验方法加以确认;哮喘是典型的复杂性疾病,Hwang等构建了哮喘的疾病蛋白相互作用网络,网络分析揭示的疾病通路与文献报道的疾病通路一致,同时还发现了一些潜在的药物靶蛋白如GNB2L1,BRCA1,为哮喘药物的研发、作用机制研究提供新思路;Chen构建肿瘤细胞凋亡的蛋白-蛋白相互作用网络,发现了3个潜在的药物靶点;Schoeberl等应用网络分析发现在ErbB通路中最佳的肿瘤治疗靶点,这表明网络分析能有助于关键通路的识别和优化治疗靶点。我国学者李梢等基于治疗相似性、化学结构相似性及蛋白-蛋白相互作用网络开发了drugCIPHER用于药物靶点的识别;徐筱杰等运用分子对接和网络药理学方法,研究治疗慢性肾病中药所含化学成分和靶标之间的相互作用,快速筛选出治疗慢性肾病中药中的有效成分群及其关键靶标,为中药的研发和作用机制提供重要参考。上述研究表明,网络生物学已广泛用于药物靶点识别、代谢通路模式的发现和作用机制的研究。3.3中药、复方作用的生物网络罗国安教授认为中药复方作用于人体即是一个“干预系统(中药复方)—应答系统(生物机体)”相互作用整合的生物学过程。随着疾病生物学研究的深入,人们更清楚地认识到大多数慢性复杂性疾病都与复杂的生物网络系统密切相关,复杂疾病的治疗需要同时调节多个药物靶点,药物作用于人体是一个复杂的生物网络调节过程。网络生物学方法可构建复杂疾病的生物网络,通过网络拓扑特征分析可以获取疾病生物网络的功能模式(module)、网络模体(motifs)及潜在的药物靶点,这揭示了中药的作用对象——“生物机体”的生物学特征。中药及其复方通常包括多个有效物质成分,可以同时作用于多个药物靶点,从不同水平调节疾病信号通路以治疗疾病。以网络调节为特点的慢性复杂病证适宜于“多组分、多靶点”的组合干预。因此应用网络生物学的方法来研究“干预系统(中药复方)”、“应答系统(生物机体)”的系统内部及系统间关系,最有可能揭示中药复方复杂的药理作用机制。4基于网络生物学的中医药联合办学和靶点协调机制的研究理念4.1生物数据库技术各类生物信息数据库的涌现及其不断完善为生物网络的构建提供丰富的资源。一些国家的研究机构已建立基因、蛋白、代谢物网络数据库,见表1,并且得到各国科学家的认可。如OMIM数据库中收录了迄今已知的人类遗传疾病及其相关基因;DrugBank数据库收录了详细的药物及其药靶蛋白信息;HPRD数据库收集了人类蛋白相互作用信息;KEGG数据库收录了较完整的生化代谢反应数据,这些数据库是网络构建的宝贵资源。近年来,各种高通量、高分辨率“组学”技术和分子生物学技术的应用,使人们比以往任何时候都更快地获取海量的生物学数据。同时数据挖掘技术和系统建模等方法的迅速发展,加速了人们解剖生物数据的能力,使人们能够更快、更准确地读懂生物数据中隐藏的生物信息。越来越多的与疾病发病机制相关的基因、蛋白、信号通路被发现,使疾病的生物网络不断完善。4.2表型网络的内容从代谢组学观点来看,“体液代谢指纹图谱”可以准确地表征药物作用引起的内源性代谢物的变化,直接反映体内生物化学过程和状态的变化。通过测定体液的组成变化,就可能得到关于外源性化合物与生物体作用的位点、强弱、效果、代谢通路等方面的信息。因此,作者认为构建表型网络能直观地体现内源性代谢物之间关系。表型网络的构建:r为皮尔森相关系数,Xi表示第i次采集的生物样本某内源性代谢物面积,为整个样本采集周期代谢物均值,Yi表示另一内源性代谢物面积,为其均值,SX,SY分别为X,Y标准偏差,如果任意2个内源性代谢物皮尔森相关指数大于0.8,则X和Y在网络中相互连接,即在网络图中,顶点表示代谢物,如果2个顶点相邻表示它们的皮尔森相关系数大于0.8。4.3复方中药作用机理的系统生物学分析方法首先根据4.1构建疾病生物网络(基因网络、蛋白网络及代谢网络等),获取基因调节、潜在药物靶点、代谢通路等信息;第二,构建假手术组和疾病模型组实验动物表型网络,为了便于比较分析2组网络差异,网络构建中,每次均可固定相同代谢物在网络中的位置,找出正常组和疾病组表型网络的差异即发生变化的内源性代谢物,然后映射到构建的代谢网络,找寻正常组和疾病组内源性代谢物代谢通路的改变,分析代谢通路中生化反应涉及的酶的变化(突变),然后映射到蛋白-蛋白网络,分析代谢酶涉及的蛋白-蛋白网络及其对蛋白网络的扰动,同时在基因网络中找寻编码代谢酶突变的基因;另一方面,根据相关疾病基因数据库知识,分析疾病基因引起哪些酶的突变,对蛋白-蛋白网络、代谢网络与表型网络的影响。如此自上而下与自下而上相互佐证,相互补充,阐明疾病涉及的生物网络变化过程;第三,构建给药组和对照组表型网络,比较复方给药组与假手术组和模型组网络模型差异,揭示哪些生物网络