酵母双杂交技术在病毒蛋白-蛋白相互作用研究中的应用

酵母双杂交技术在病毒蛋白-蛋白相互作用研究中的应用

蛋白质-蛋白质相互作用在病毒的生命过程中起着非常重要的作用。病毒dna（rn）的复制、复制、rnd、去除、蛋白质翻译和分泌、信号传达和各种代谢过程与蛋白质相互作用有关。对病毒生命过程中蛋白质作用的研究有助于揭示其生命过程的许多本质问题,但由于蛋白与其他生物大分子间的作用依赖于细胞内环境,并且与作用时间和作用力密切相关,而传统的生化方法很难满足生命过程所需的各种条件,使得对蛋白间相互作用的研究进展缓慢。酵母双杂交技术的出现及发展极大地推动了这方面的研究,成为分析鉴定病毒蛋白-蛋白相互作用及调控的强有力工具,并显示出了广泛的应用前景。1酵母双杂交体系的构建酵母双杂交技术又称“相互作用陷阱”(interactiontrap),是Fields等于1989年建立的研究蛋白间相互作用的遗传学方法。该技术是在对真核生物调控转录起始过程认识的基础上建立起来的。研究表明,许多真核细胞的基因转录起始需要反式转录激活因子的参与,这些反式转录激活因子是由结构和功能相对独立的DNA结合结构域(DNA-bindingdomain,BD)和转录激活结构域(transcriptionalactivationdomain,AD)组成的。不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的转录激活功能,二者对特定基因的激活表达缺一不可。酵母双杂交体系的构建如下所述:将编码已知蛋白质(常称为诱饵蛋白质,baitprotein)的基因与编码DNA结合结构域的序列融合,在酵母中表达产生融合蛋白质BD-Bait;将编码未知蛋白(常称为捕获蛋白质,preyprotein)的基因与编码转录激活结构域的序列融合,并在酵母中表达产生另一融合蛋白AD-Prey。之后,2种融合蛋白在酵母中共表达,如果Bait和Prey能发生作用,将引导BD和AD相互结合并产生具有功能的转录激活蛋白,从而激活报告基因转录;如果Prey和Bait不能相互作用,则BD和AD不能结合,报告基因的转录就不能被激活。因此,可通过检测报告基因是否被转录来研究蛋白质间的相互作用。如果将Prey换成基因文库,即可直接从基因文库中筛选到能与Bait相互作用蛋白的DNA序列。2采用双杂交繁殖技术在病毒学研究中的应用酵母双杂交技术是一个具有开创意义的研究方法,已经广泛地运用在病毒分子生物学研究的各个领域。其最主要的用途有以下4个方面。2.1hbv在细胞内抑制tnf-功能酵母双杂交技术在病毒学研究中最为重要的用途是,从宿主细胞cDNA文库中筛选与病毒特异性蛋白质相互作用的未知蛋白。即将宿主细胞cDNA与AD序列相互融合,已知病毒特异性蛋白基因与DNA-BD序列结合,通过检测报告基因的转录情况,寻找与已知病毒蛋白发生作用的未知宿主蛋白质。利用该方法已经证实了许多未知蛋白间的相互作用,揭示了大量未知蛋白的功能及调控机制。腺病毒E3所编码的E3-14.7×103蛋白能抑制TNF-α的功能,Yongan等利用酵母双杂交技术从Hela细胞的cDNA文库中发现了一个特殊的宿主蛋白FIP-2,它是E3-14.7×103在细胞内的靶蛋白,E3-14.7×103通过与FIP-2结合来实现对TNF-α的抑制功能,从而揭示了腺病毒能够抑制肿瘤坏死因子功能的机理。乙肝病毒(HBV)X基因的表达产物HBX是一个功能复杂的蛋白质,它在病毒的感染、复制、转录等过程中均起重要作用。Melegari等也用双杂交技术从肝癌细胞cDNA文库中找到与HBVX蛋白(HBX)结合的宿主蛋白IXP,并证实IXP能够通过与HBX的结合抑制病毒活性,从而改变病毒的复制周期。这一发现为研究HBV感染机制及治疗提供了有用的信息。Mamiya等用类似方法,以丙型肝炎病毒(HCV)C蛋白为诱饵,从人肝细胞cDNA文库中发现一种ATP依赖性RNA螺旋酶——DBX,它能使细胞内帽依赖性RNA的翻译受到抑制而不影响病毒RNA的翻译。EB病毒的BHRF1蛋白具有抗细胞凋亡作用,能够抵抗多种刺激引起的细胞凋亡。Li等从人包皮角化细胞cDNA库中筛选到一种可与BHRF1相互作用的蛋白——PRA1蛋白,它能减弱BHRF1的抗细胞凋亡活性,可能起着阻碍病毒成熟的作用。2.2hcvc蛋白与细胞间相互作用的研究酵母双杂交技术创立之初就是为了用来研究已知蛋白质之间相互作用的。目前,通过该系统已经确定了许多重要蛋白质之间的相互作用。在病毒学研究方面,可用于病毒与宿主蛋白之间和病毒自身蛋白之间的相互作用研究,以探讨病毒生物学过程的发生机制。2.2.1确定病毒蛋白与宿主受体蛋白间的相互作用,揭示病毒与宿主之间的关系,为预防病毒感染奠定基础Frederickson利用该系统证实SV40的大T抗原可以与P53蛋白和R6蛋白相互作用,从而揭示了SV40引起细胞转化的机理。Tai等报道,HCVC蛋白通过与NF-κB相互作用,降低了细胞对TNF诱导凋亡的敏感性,有利于病毒的持续感染,并与肝细胞癌变有关。You等运用酵母双杂交技术研究HCVC蛋白与人肝癌HuH-7细胞核内RNA螺旋酶CAP-Rf之间的关系,发现C蛋白能增强RNA螺旋酶CAP-Rf的活性,间接影响细胞的RNA代谢。Momose等利用该杂交技术发现细胞内的剪接因子RAF2-P48蛋白能够与流感病毒NP蛋白形成RAF2-P48-NP复合物,随着细胞内游离RNA的增加,RAF2-P48-NP复合物逐渐解离成RAF2-P48和NP,RAF2-P48又促使NP和RNA形成NP-RNA复合物,其作为病毒RNA聚合酶的模板,促进流感病毒RNA的合成。这为流感病毒的致病机理研究奠定了基础。2.2.2确定病毒已知蛋白间的相互作用,研究病毒生理过程的本质欧武等通过对HCVNS3N末端氨基酸缺失,研究了NS3/NS3及NS3/NS4A分子间相互作用。结果发现,NS3N末端氨基酸缺失前后,NS3/NS3分子间及NS3/NS4A分子间相互作用的强度差异显著,但缺失15个氨基酸和缺失30个氨基酸对上述相互作用强度的影响不明显。这表明NS3N末端的第1~30个氨基酸残基在NS3/NS3及NS3/NS4A分子间相互作用中有一定意义,其中前15个氨基酸(APITAYSQQTRGLLG)更为关键。这为抗NS3丝氨酸蛋白酶活性的多肽抑制物的研究打下了基础,并为抗HCV小分子多肽类药物的设计提供了依据。Fuchs等对伪狂犬病病毒高度保守基因产物UL31和UL34蛋白进行了研究,发现UL31和UL34相互作用是伪狂犬病病毒在内核膜形成初级包膜的先决条件,内核膜和外核膜融合后,初级包膜消失,证明UL31和UL34是病毒初级包膜的组成成分,而不是成熟病毒颗粒的成分。2.3蛋白质杂交检测酵母双杂交技术还是确定蛋白质作用功能区域(位点)的一种有效方法。当确定了2种蛋白质存在相互作用后,可以利用分子克隆技术将其中1种蛋白质进行一系列缺失突变,通过缺失不同的片段来验证该蛋白在双杂交系统中是否仍具有激活转录功能,从而确定蛋白质相互作用的重要功能区域;还可将蛋白质进行一系列的点突变,以进一步确定影响蛋白质相互作用的重要氨基酸位点和起关键作用的氨基酸残基。这是双杂交系统的特点所决定的,因为它是在DNA水平上表达蛋白质,只要缺失掉相应的DNA片段即可达到目的,而传统的检测方法则无能为力。另外,该杂交技术还可用于研究蛋白质的结构与功能。Li等利用该技术研究p53和SV40大T抗原的结合实验时,对p53进行突变,发现突变型的P53失去了和T抗原结合的能力,经双杂交确认,它的第4个ankyrin保守序列缺失,使抑癌功能丧失,这和一些癌症患者的P53蛋白发生突变是一致的。Zhu等认为,丙型肝炎病毒C蛋白N末端36~91氨基酸,可与LT-βR的C末端结合。LT-βR属于TNF受体家族成员,可加强TNF诱导的细胞凋亡作用;同时,C蛋白亦可通过与TNF尾端345~407氨基酸残基结合,从而提高细胞对TNF的敏感性,促进宿主细胞凋亡。2.4酵母三杂交系统所激活的基因RNA与蛋白质的相互作用是某些病毒生命活动的基础。在RNA病毒感染过程中,RNA病毒与宿主蛋白质间的相互作用对病毒感染和复制的影响、病毒mRNA的加工和翻译、病毒增殖过程中mRNA的稳定性以及mRNA活性的调节等,这些关于病毒RNA与蛋白质相互作用的问题还未得到解决,而应用传统的酵母双杂交技术不能回答这些问题。通过对酵母双杂交技术进行不断改造,衍生出了酵母三杂交技术,才逐渐加深了对RNA病毒的认识。1996年,Putz等将酵母三杂交技术扩展到了RNA研究领域。他们将HIV-1的RevM10突变体蛋白与Gal4BD融合,再与其靶RNA即Rev应答元件(revresponsiveelement,RRE)结合;另又构建一个RRERNA与蓁类RNA相连产生的杂合RNA文库,之后,在AD-Prey中筛选出与这类RNA相结合的RNA结合蛋白质。Bacharach等用酵母三杂交系统研究发现,HIV1Gag蛋白可以特异性地与HIV衣壳体信号的含4个茎环结构的139个核苷酸RNA结合,明显激活报告基因的转录。Gag蛋白突变后或HIV衣壳体信号改变后,都使基因的转录降低。SenGupta等应用酵母三杂交系统对HIV反式激活因子(Tat)与反式激活元件(Tar)之间的关系进行了研究。将HIVDNA结合区蛋白与噬菌体MS2包膜蛋白构建成第1个融合基因,Tat与激活转录区蛋白构建成第2个融合蛋白。Tat可以识别并特异地与Tar的59个核苷酸RNA结合,使HIV在细胞内复制,增加病毒的感染性。将Tar基因克隆进R17噬菌体,可被转录形成5′端为R17噬菌体21个碱基对的茎环结构,3′端为Tar的杂合RNA分子。将3种质粒共转染酵母,三者的相互结合作用明显激活报告基因的转录,对照实验中用反义Tar代替Tar,或者不存在Tar、Tat蛋白,均不能激活报告基因的转录。HIV反式激活因子Tat与病毒间的作用机理的揭示,有望成为AIDS治疗的靶点。3价格补充酵母双杂交技术已经在病毒分子生物学研究领域发挥了巨大作用,但仍具有很大的发展潜力。3.1小分子多肽药物的合成在治疗病毒病的方法中,基因治疗是最具前途的方法之一,基因治疗中的效应产物是多肽。最新研究表明,酵母双杂交技术尚可推广到蛋白质-多肽作用的研究及对肽类药物的筛选中。利用酵母双杂交技术筛选出和病毒蛋白相互作用的多肽,完全可以得到一些具有药物治疗作用的小分子多肽药物,从而揭示药物与细胞、组织、机体的相互作用,确定基因治疗的机理。Yang等的实验结果表明,Leu-X-Cys-X-Glu多肽可以