铜对草鱼肝脏中谷胱甘肽的影响

铜对草鱼肝脏中谷胱甘肽的影响

在代谢过程中，污染物会产生许多生物反应（ros），导致过氧化，对需氧生物的潜在毒性影响。必须尽快清除。还原性氨基葡萄糖（gsh）是生物中的重要活性物质。它不仅可以用作谷神经激素（pgx）和谷神经激素硫旋酶（gst）的物质，而且可以直接结合在一起。它在解毒和代谢生物体中发挥着重要作用。报道了国外在水生生物暴露条件下对gsh的变化进行的研究，但在国内研究相对较少。谷胱甘肽还原酶(GR)是一种黄素蛋白氧化还原酶,在不同的胁迫反应中有不同的作用.GR的表达能导致叶片中谷胱甘肽的水平倍增.在氧化胁迫反应中,它对保护细胞内谷胱甘肽库大部分处于还原状态起关键作用.谷胱甘肽必须以还原形式GSH来完成许多功能,尤其是在清除活性氧中介如过氧化物、过氧化氢等氧化剂中起重要作用,如果活性氧不被清除,将直接或间接地通过脂质过氧化的产物引起细胞组分(如酶、DNA、膜)发生破坏.GSH在γ_谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的连续作用下合成,又可在谷胱甘肽还原酶(GR)的作用下由氧化型谷胱甘肽(GSSG)转化而来.铜是水环境中重要的污染物之一,对水生生物的毒性很强.而低剂量铜暴露因其接近现实,更应该引起关注.通过测定水生生物特定的生理生化指标来确定污染的存在与否是十分必要的.本文通过铜及其配合物低浓度长期暴露后对鲫鱼肝脏谷胱甘肽系列的影响,探讨Cu2+的致毒机理以及有机配体的加入的影响.1材料和方法1.1试剂和仪器紫外可见分光光度计(北京瑞利)、Microfuge22R高速冷冻离心机(美国Beckman公司).硫酸铜、EDTA二钠盐均购自Amerco公司,其余试剂均为国产分析纯.1.2区域主养试验型.彭泽鲫鱼(Carassiusauratus)购自南京市水产研究所禄口养殖基地,其平均体长为(7.10±0.65)cm,平均体重为(5.32±0.045)g.驯养采用除氯自来水,水温为(16.0±1.0)℃,实验前驯养14d,死亡率小于5%.随机选取个体差异不大、健康活泼的鲫鱼用于暴露试验.1.3cuedtacu在40L水族箱中分别加入20L试验溶液,每组投8尾鲫鱼,暴露时间为40d.Cu2+暴露浓度分别为0、0.0025、0.005、0.01、0.05、0.25、0.75mg/L,Cu_EDTA处理根据MINTEQ程序,按照与Cu2+有99%络合率,加入EDTA二钠盐溶液,并设对照.采用静态置换法,每天更新溶液50%,每天投颗粒状饵料一次.1.4gsh含量的测定40d后,活体解剖,取出肝脏,迅速置于液氮中,-80℃低温保存.测定时,加10倍体积预冷的缓冲液,冰浴下匀浆,4℃冷冻离心(10000r/min转速冷冻离心10min),上清液用于样品测定.1.4.1蛋白质测定用Bradford方法测定,见文献.1.4.2GR活性测定反应体系中含1mol/LEDTA,1mol/LGSSG,0.2mol/LNADPH,0.1mol/LPBS(pH7.8)及酶样上清液.1.4.3GSSG含量的测定1.4.4GSH含量的测定参照Cohn和Lyle的方法,略做改动.最终的反应体系中含2.8mL的0.1mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液[pH8.0,c(EDTA)=0.005mol/L],100μL稀释上清液和100μLOPT(2mg/mL甲醇).混匀后于室温15min测定,激发波长350nm,发射波长420nm,通过标准曲线计算GSH含量(μg/g).1.5数据处理方法实验数据进行统计学处理.所获的结果均为平均数±标准误差(Mean±SD)表示,并用单因素方差分析方法和单边t检验法,对组间数据进行差异性显著分析,P≤0.05,被认为是差异显著.2结果与讨论2.1cu2+对gr活性的影响EDTA配合物对鲫鱼肝脏谷胱甘肽还原酶(GR)活性的影响图1为Cu2+及Cu_EDTA对鱼体肝脏中谷胱甘肽还原酶的影响随浓度不同的变化.与对照组相比,在暴露浓度均为0.0025mg/L时,两种形态铜离子对GR基本无影响.暴露在Cu2+浓度0.005mg/L中的谷胱甘肽还原酶活性被轻微地激活,而暴露于相同浓度Cu_EDTA中则被显著抑制(P≤0.05).当暴露浓度大于0.01mg/L时,Cu2+对GR活性的影响随浓度增大抑制程度加深,0.25mg/L处理组与对照相比,差异显著(P≤0.05);而暴露于Cu_EDTA中的鱼肝GR活性却有激活的趋势,0.01mg/L组与对照相比有显著差异(P≤0.05).2.2cu2+及cuedta对人体gssg含量的影响实验结果见表1,从表1中可看出,Cu2+及Cu_EDTA对鱼体肝脏中氧化型谷胱甘肽的影响随浓度不同的变化.与对照组相比,除0.25mg/LCu2+处理组低于对照外,暴露于Cu2+及Cu_EDTA溶液中的GSSG含量均有不同程度的提高,说明Cu2+及Cu_EDTA进入鱼体肝脏对GSSG产生一定的激活作用;但浓度过高之后又可能产生抑制作用,可能是Cu2+暴露浓度比较大时,机体经Cu2+代谢产生的大量活性氧,直接与GSSG的巯基结合,消耗GSSG,导致其含量降低.在浓度高时(0.25mg/L),两种形态铜离子对GSSG的作用不同,暴露在Cu2+中的GSSG含量比对照减少,而Cu_EDTA处理组对GSSG仍表现出激活作用.2.3cuedta和cuedta对鱼肝EDTA配合物对鲫鱼肝脏还原型谷胱甘肽(GSH)含量的影响实验结果见表2.从表2中可看出,Cu2+及Cu_EDTA对鱼体肝脏中还原型谷胱甘肽的影响随浓度不同的变化.与对照组相比,暴露于Cu2+溶液中的GSH含量均有不同程度的提高,0.01～0.25mg/L浓度组与对照组相比均达到显著差异,其中0.01mg/L浓度组增幅最大,GSH含量可达对照的167%.Cu_EDTA处理组对鱼肝中GSH也有轻微激活作用.0.005mg/LCu_EDTA浓度组与对照相比,有显著的激活,GSH含量增加115%.这说明Cu2+及Cu_EDTA进入鱼体肝脏对GSH产生一定的激活作用,Cu2+对GSH的激活率相对高于Cu_EDTA处理.两种形态铜离子对于鱼肝GSH的不同作用机理有待于进一步研究.在Cu2+及Cu_EDTA胁迫下,肝脏GSH被诱导,表明肝脏作为体内重要的代谢和解毒器官,其中的GSH活跃地参与不同形态铜的代谢活动.冯涛等认为,肝脏GSH含量的升高可以认为是机体对污染物暴露的适应性反应.2.4edta和cuGSH/GSSG比值的变化如图2所示,两种形态铜在低浓度(0.0025～0.005mg/L)时表现较为相似,GSH/GSSG比值的差异不大,基本保持一致,均在0.0025mg/L时有轻微减少,而在0.005mg/L时,出现明显的增加,EDTA处理组的GSH/GSSG比值略高于Cu2+处理.而在浓度高于0.01mg/L时,则表现出不同影响,Cu2+处理的GSH/GSSG比值保持较高水平,而Cu_EDTA处理的GSH/GSSG比值则降低到与空白对照接近的水平.两种形态的铜暴露,随着暴露浓度增大,产生氧化应激,GSH含量发生适应性的增加,GSH/GSSG比值相应增加.3cuedta和cuedta对gsh的诱导表达氧化型谷胱甘肽(GSSG)、还原型谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽还原酶(GR)在抵御氧化胁迫方面既独自起作用,相互之间又密切联系.Cu2+对GR的影响表现出先诱导后抑制的趋势,而后随暴露浓度的增加抑制程度加深.Cu_EDTA对GR均有抑制作用,在0.01mg/L时达到显著差异.Cu2+对GSSG的影响表现出先显著诱导,浓度增大后出现了被抑制的现象,这可能是由于过量的Cu2+与GSH的巯基