基于quechers技术的农药残留检测前处理技术

基于quechers技术的农药残留检测前处理技术

农业中残留农药的分析是检测农业质量安全的主要内容。加强对农药残留量的检测和环境毒理研究,对于合理开发和正确使用化学农药,保护生态环境,保障人类健康,避免和减少不必要的农业损失和国际贸易争端等具有重要的理论和实践意义。近年来,气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)、超临界流体色谱(SPC)、毛细管电泳色谱(CE)和酶联免疫吸附(ELISA)等分析技术已经成为当前主要的农药残留分析技术。现代检测技术对样品的前处理提出了更高的要求,因此,快速、准确、安全、高效的样品前处理新技术的开发需求也日益迫切。目前已经广泛应用于实际操作的前处理方法有固相萃取(solid-phaseextraction,SPE)、固相微萃取(solid-phasemicroextraction,SPME)、凝胶渗透色谱(gelpermeationchromatography,GPC)、超临界流体萃取(supercriticafluidextraction,SFE)、加速溶剂萃取(acceleratedsolventextraction,ASE)、微波辅助萃取(microwave-assistedextraction,MAE)、基质固相分散(matrixsolid-phasedispersion,MSPD)等。但这些方法均很难同时对绝大多数农药达到较高质量的提取分析。2003年,美国农业部Anastassiades教授等开发了一种新的样品前处理技术——QuEChERS方法,较好地解决了这个问题。自QuEChERS方法出现以来,引起了农残工作者的普遍关注,也逐渐对它进行了方法改进,使其在各领域样品前处理中的应用日益广泛。1quehens方法QuEChERS方法是近年来国际上最新发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术。因其具有快速、简单、廉价、有效、可靠、安全的特点而得名QuEChERS方法,此技术一经发现就吸引了大量农残研究者的目光。其原理与高效液相色谱(HPLC)和固相萃取(SPE)相似,都是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用,吸附杂质从而达到除杂净化的目的。实验发现,乙腈为最适合萃取宽范围极性农药多残留物的溶剂,可用于色质联用分析;无水MgSO4吸水的同时也产热,使萃取液的温度更适合农药的萃取;离心促使提取液与混浊的样品分层;再次加入无水MgSO4为吸取多余的水分;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)吸附剂能够清除许多极性基质成份如来自样品共萃取物的脂肪酸、某些极性亲脂性色素和糖类等,而对农药残留物无吸附作用。随后的研究进一步证实有超过200种农药可用此法分析,其中包括含脂肪的介质体系。其技术核心是在农作物(水果、蔬菜等)的提取液中直接加入除水剂和杂质吸附剂,提取液经离心之后直接进行色质联用分析。由于不需经过传统前处理的提取液浓缩干燥、过固相萃取柱净化等步骤,所以这是一种省时、经济和适用面广的新技术。最近QuEChERS方法已经被做为AOAC的标准方法用于水果和蔬菜的农残检测中。QuEChERS方法的步骤可以简单归纳为:(1)样品粉碎;(2)单一溶剂乙腈提取分离;(3)加入MgSO4等盐类除水;(4)加入乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)等吸附剂除杂;(5)上清液进行GC-MS、LC-MS检测。与传统的SPE等前处理方法相比,QuEChERS方法有以下优势:(1)回收率高,对大量极性及挥发性的农药品种的回收率大于85%;(2)精确度和准确度高,可用内标法进行校正;(3)可分析的农药范围广,包括极性、非极性的农药种类均能利用此技术得到较好的回收率;(4)分析速度快,能在30min内完成6个样品的处理;(5)溶剂使用量少,污染小,价格低廉且不使用含氯化物溶剂;(6)操作简便,无需良好训练和较高技能便可很好地完成;(7)乙腈加到容器后立即密封,使其与工作人员的接触机会减少;(8)样品制备过程中使用很少的玻璃器皿,装置简单。2que斋在食品中检测农药残留的应用2.1quech在水果、蔬菜和农药残留检测中的应用研究2.1.1quehens检测方法QuEChERS方法作为一种标准方法被开发是首先应用于果蔬当中,所以目前QuEChERS较为成熟的应用仍是在果蔬等含水量较大的基质中。但已有部分实验室开始尝试用于其他农产品和水产品的农残药残分析,并取得了一些成果。国内近年才引进此方法,并由中国农业大学开发了用于水果蔬菜中农残检测的第一个农业部标准——NY/T1380—2007。国外对QuEChERS方法较早的研究中,多以单一的PSA为除杂剂,检测的农药种类也以氨基甲酸酯类等少数几种农药为主,分析多以GC、HPLC、GC-MS进行。2005年,Lehotay等在莴苣和橘子样品中加入229种10~100ng/g农药混标后,取15ml加标样品,加入6g无水MgSO4和1.5gNaCl,取出上清液加入1.8g无水MgSO4和300mgPSA,经GC/LC-MS检测,回收率在70%~120%(其中206种农药回收率达90%~110%),相对标准偏差小于10%。同时,另一组实验中,尝试了加入1%的乙酸缓冲剂,净化时每毫升萃取液加入150mg无水MgSO4和50mgPSA,确保基质pH在4~5之间,最大程度的降低碱性敏感的农药残留物的降解,结果表明,碱性敏感农药:灭菌丹(folpet)、抑菌灵(dichlofluani)、百菌清(chlorothaloni)、吡嗪酮(pymetrozine)等回收率达到95%±5%以上。可见加入缓冲剂有利于碱敏感农药的回收。2.1.2本方法的回收率和精密度随后的诸多研究依据前人的经验在缓冲溶液的使用、除杂剂的选择等方面有了很大的进步,实验结果的准确性和精密度也有较大提高。2007年,Payá等在黄瓜、柠檬、柑橘样品中,运用改良的QuEChERS方法,在第一步提取时,添加柠檬酸钠和柠檬酸二钠作为缓冲保护剂,在酸性较强的柠檬中额外加入600μl的NaOH来调节pH值。在离心后的每毫升提取液中加入150mgMgSO4、25mgPSA,提取液中加入10μl5%甲酸进行再酸化,然后分别进行GC-MS/MS、LC-MS/MS分析。检测限为0.01~0.1mg/kg,平均回收率为70%~110%,相对标准偏差≤10%。此结果证明,加入柠檬酸盐,建立缓冲体系对某些对酸碱敏感的农药的分离有良好的作用。Garrido等开发了一种极为简单的QuEChERS方法即在非脂肪体系的粉碎样品中,直接加入1%乙酸的乙腈提取,再加入4g无水MgSO4和1g醋酸铵振荡离心后上清液直接装瓶进UPLC-MS/MS检测;对脂肪体系的样品,则在离心后过佛罗里硅土固相萃取柱净化后上机检测。醋酸铵是构成酸性缓冲体系的物质,对于维持溶液的pH值,防止对碱敏感农药的降解。国内对QuEChERS方法较早的研究中,也多以单一的PSA为除杂剂,检测的农药种类也以氨基甲酸酯类等少数几种农药为主,分析多以GC、HPLC、GC-MS进行。而在LC-MS、LC-MS/MS等液质联用方面的研究比较少。2005年,沈阳农业大学和天津市大港区农林畜牧局合作研究了果蔬中35种有机磷和有机氯的农药残留检测,研究以乙腈为提取溶剂,PSA和无水MgSO4进行分散固相萃取(Disperse-SPE),GC-MS检测、方法的加标回收率在70%~110%之间,取得了很好的提取净化效果。中国农业大学的潘灿平工作组是国内较早引进QuEChERS方法检测农药残留的,2005~2006年,该工作组用QuEChERS测定了枸杞中的包括菊酯类在内的12种农药以及吡虫啉、阿维菌素的残留。对于枸杞这种糖类、色素含量较高的样品,亦取得了较好的效果。2.1.3改良型的quehens方法除了建立缓冲体系,研究人员还在吸附剂地选择上有所创新,单纯的吸附剂PSA也陆续与其他的吸附剂相配合,以适合更多成分复杂的样品,达到更好地除杂效果。国外对QuEChERS前处理,色质联用分析检测农药残留的研究中,更注重对色谱、质谱条件的改进,对QuEChERS的改良多体现在缓冲溶液的使用上,对吸附剂选择上改良并不多。例如Antonio、Nguyen、Banerjee等在QuEChERS做前处理时,使用的都是没经过改良的QuEChERS方法,即乙腈提取,PSA、无水MgSO4除杂。但也有人在尝试添加ODSC18、GCB等改善提取效果。国内在新型吸附剂地选择方面发展很快。董静等在改良型的QuEChERS方法研究上做出了很多成就,在用0.1%冰醋酸-乙腈溶液提取后,净化时,除PSA外,额外加入ODSC18粉、石墨化炭黑(GCB)、氨丙基粉等吸附剂,PSA去除脂肪酸效果较好,去除色素、维生素的效果一般,而ODSC18粉、石墨化炭黑(GCB)除色素、维生素的能力较好,这种混合型的分散固相萃取可以明显改善净化效果。用改良型的方法用于果蔬中包括有机磷、有机氯、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类在内的54种农药的检测,检出限在3~25μg/kg之间,在添加含量0.05~1.0mg/kg范围内回收率在60%~120%之间,标准偏差在4%~14%,达到了农残检测的要求。邵华等用石墨化碳分散固相萃取GC-MS法测定蔬菜中的48种农药多残留,内标法定量,利用GCB去除色素,在GCB的用量、GCB加入的时间方面进行研究,确定了20g样品中,加入GCB的量在0.5g为宜,且在均质后的提取液中加入效果较好。并且通过浓缩,大大降低了样品的检出限,满足了最低检出量(LODs)小于最大残留限量(MRLs)的要求。在缓冲溶液和吸附剂的选择方面所做的改良都为更好地提取和净化创造了条件,也使处理的样品能满足更多种检测器的需要。2.2提取溶剂的选择及萃取方式对样品残留的影响粮谷不同于水果蔬菜,含水量很小,而QuEChERS最初是对含水量大于75%的样品所设计,对于粮谷这种干燥的样品,在处理时加入一定量的水,普遍采用的仍是乙腈提取,PSA、MgSO4净化。Diez等应用改进型QuEChERS处理磨碎的大麦样品,2.5g样品加入7.5g水,再用10ml乙腈提取,4gMgSO4、1gNaCl、25mgPSA等净化。并同时与LUKE法和乙酸乙酯提取的前处理结果进行对比,并分别用GC-TOF/MS和LC-MS/MS检测得到的前处理样品。结果表明,QuEChERS的基质效应最小,线性最好。并不是所有的干燥的样品都要加水,在不加水时,可以直接用乙腈萃取沈菁等就以乙腈为萃取溶剂浸泡过夜,PSA、MgSO4净化,实现样品快速制备。液相色谱电喷雾质谱定量检测大米中呋喃丹的残留量。加标回收率和RSD值,均符合农药残留的分析要求。以上研究更加验证了QuEChERS做为一种新技术,在对干燥样品的处理上也是可行的,具有很强的实用价值。2.3净化条件的确定以上的研究多集中于植物性食品,在对动物组织,如肌肉组织中兽药残留的研究方面,QuEChERS也发挥了一定的作用。董静工作组建立了一种QuEChERS-HPLC法检测动物组织中克球酚、地克珠利和磺胺类药物残留量。由于动物组织的特殊性,该研究是用14ml乙腈与氯仿为10:1的混合溶液代替乙腈,并加入10ml10%硫酸钠溶液来提取,依据基质情况差异添加ODSC18粉末、PSA粉末、氧化铝粉来净化。原QuEChERS方法用PSA去除果蔬中的脂肪酸、色素,而动物组织中含有大量蛋白和脂肪,所以净化过程中同时考虑使用ODSC18粉和中性氧化铝粉,采用混合型分散固相萃取净化,各种吸附剂粉末的用量也针对不同的样品基质进行调整。7种化合物检测限至少能分别达到:克球酚0.05mg/kg、磺胺类0.05mg/kg、地克珠利0.1mg/kg。在添加回收率实验中,当添加水平在0.1~1.0mg/kg范围内,回收率均可在65%~100%之间,相对标准偏差在1%~10%之间。由此可见,QuEChERS不仅可以处理植物中的糖类、脂肪酸、色素等,对动物性食品中的蛋白和脂肪的净化也有不错的效果。2.4分离提取的检测牛奶中含有大量的水分、蛋白质和脂肪,这些大分子物质对色谱系统造成干扰,严重影响色谱柱的寿命。以往的前处理方法多为液液萃取、SPE净化,此法耗时、花费高。西班牙的Aguilera-Luiz开发了一种改良型QuEChERS-UPLC-MS/MS法测定3种牛奶(全脂、半脱脂、脱脂)中18种兽用抗生素残留的方法。用含1%乙酸的乙腈和0.1mol/LNa2EDTA提取,无水MgSO4和CH3COONa净化,过滤稀释后直接进UPLC-MS/MS检测,结果显示,最低检出限(LOD)为1~4μg/kg,加标回收率为70%~110%,相对标准偏差(RSD)小于21%,适合于牛奶中常见抗生素的快速准确定量、定性分析。对蜂蜜这样黏稠、含水量小的样品而言,前处理亦是一个难点。蜂蜜中的糖类和有机色素等极性干扰物会对农药的提取产生很大的干扰。初级次级胺(PSA)可以有效的吸附这些干扰物质。陈舒舒等建立了反相高效液相色谱-离子阱质谱法检测蜂蜜中氯霉素残留的方法。前处理采用改良的QuEChERS方法进行快速提取和净化,采用PSA进行固相分散净化,可有效吸附蜂蜜中的糖类及有机色素等杂质。用电喷雾电离法(ESI)负离子模式、多反应离子监测(MRM)对氯霉素进行定性定量分析。在0.2~200μg/kg的添加浓度下,添加回收率水平在78%~93%间,变异系数在3.9%以下。表明该法适用于动物性产品中氯霉素的快速定性、定量检测。2.5