偶合反应化学发光酶联免疫分析测定人血清甲胎蛋白

偶合反应化学发光酶联免疫分析测定人血清甲胎蛋白

1偶合反应化学发光酶联免疫甲胎蛋白是核电站癌的诊断指标，在临床评价中发挥着重要作用。目前使用的间接血凝、琼脂双扩散、电泳和酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法灵敏度不高,放射免疫分析又存在放射性危害等问题。为此,我们提出一种偶合反应化学发光酶联免疫分析测定人血清甲胎蛋白的新方法。此方法偶合辣根过氧化物酶(HRP)催化H2O2氧化曙红(Eosin)的反应和HRP催化H2O2与鲁米诺(Luminol)的化学发光反应,利用前一反应的中间产物具有增强后一化学发光反应的特性,提高化学发光信号强度;通过测定标记在甲胎蛋白抗体上的HRP的量,求得发生免疫反应的甲胎蛋白含量,测定原理见图1。实验结果表明,本法测定人血清甲胎蛋白的灵敏度高,仪器简单,对健康无损害,测定范围为0.10～100.0ng/ml甲胎蛋白,比ELISA法灵敏度高10倍,与放射免疫法(0.10～10ng/ml)灵敏度相当,能满足临床检验需要。2实验部分2.1血清白蛋白,洗涤液和概念测定LKB-1250化学发光光度计(瑞典LKB公司)。标准甲胎蛋白溶液,甲胎蛋白抗体和HRP标记的甲胎蛋白抗体(第四军医大学附属二院提供);载体:聚苯乙烯小珠,Φ6.4mm(上海塑料研究所);抗原和抗体稀释液:1%牛血清白蛋白溶液;包被缓冲液:0.01mol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液(pH9.5),用于包被抗体的稀释;洗涤液:称取NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO42.9g、KH2PO40.2g和Tween-200.5ml,用蒸馏水一起溶解后定容为1L;底物溶液:于25ml容量瓶中加入0.01mol/LHCl溶液0.4ml,1%Tween200.2ml、0.01mol/LEDTA1.0ml,1.0×10-3mol/L曙红溶液2.0ml和7.5×10-3mol/LH2O21.0ml,用蒸馏水稀释至刻度,此溶液用时临时配制;发光剂:5.0×10-4mol/L鲁米诺溶液(pH9.5)。2.2样品的制备和检测包被抗体:于两组小试管中各加入一粒载体小珠和0.5ml抗体稀释液,在37℃恒温孵育2h,在4℃冰箱过夜。取出后洗涤三次,制得包被抗体小珠。于第一组小试管中分别加入不同稀释度的标准甲胎蛋白溶液,作为标准对照管;第二小组试管中各加入待检血清0.1ml和抗原稀释液0.4ml,作为样品测定管。于37℃孵育2h,抽干,洗涤3次,载体上形成抗原-抗体免疫复合物。各管均加入HRP标记的甲胎蛋白抗体(1:1000)0.5ml,37℃孵育2h,用洗涤液洗三次,再用蒸馏水洗两次,在载体上形成具有HRP标记抗体的甲胎蛋白双抗体夹心免疫复合物。2.3化学发光强度测定向各管中加入底物溶液300μl,在37℃下恒温反应20min,将小试管放入发光计检测室,加入300μl5.0×10-4mol/L鲁米诺溶液,测量化学发光强度,用第一组试管所测数据绘制标准曲线,在曲线上查出第二组试管中甲胎蛋白含量。3结果与讨论3.1反渗透edta反应试验了pH值对HRP催化Eosin-H2O2反应产生发光增强剂的影响,结果表明,在pH3.4～3.6范围内最有利于反应的进行。Eosin和H2O2的最佳浓度分别为8.0×10-5mol/L和3.0×10-4mol/L。在上述反应剂条件下,于37℃反应15min可达到平衡,且1h内信号保持稳定。在有少量EDTA存在时,空白信号1h内无明显变化。本反应除pH值要严格控制外,其它反应条件较宽容。3.2化学发光反应的条件3.2.1发光动力学性质比较了直接利用HRP催化H2O2氧化鲁米诺的化学发光反应和有偶合反应参与下的化学发光反应两者的化学发光动力学性质,发现二者的发光强度-时间关系曲线的形状相似(图2),均具有快速反应的性质,发光强度在1s内均可达到峰值,3s内信号降低至零。实验中用峰高定量。3.2.2co3-nahco3缓冲液及鲁米诺浓度的选择考察了鲁米诺浓度、介质及pH值对化学发光信号的影响,发现在Na2CO3-NaHCO3缓冲液中pH9～10时发光信号最强,鲁米诺浓度在10-3～10-4mol/L范围内发光信号稳定,故选pH9.5的碳酸盐缓冲溶液,鲁米诺浓度选为5.0×10-4mol/L。3.2.3tween-20用量对反应的影响一些表面活性剂对发光信号有增敏作用,在所试验的Tween-20、Tween-80、CPS、CPC、CTMAB、TritonX-100、十二烷基磺酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚、聚氧乙烯十二烷基醚等9种表面活性剂中,以Tween-20增敏能力最强,可使峰高增加5倍左右,故在底液中加入200μl1%Tween-20以增敏测量信号。3.3偶合反应法测定抗体灵敏度在最佳反应条件下对不同稀释度(1:10x)的HRP标记甲胎蛋白抗体进行测定,并与无偶合反应参加的直接化学发光测定结果对照,结果见图3。直接化学发光法测定该酶标抗体的最低稀释度为1:6.4×10,而偶合化学发光法测定该酶标抗体的最低稀释度为1:5.1×105。由于偶合反应产生了增强剂,使该偶合化学发光法测定酶标甲胎蛋白抗体的灵敏度提高了8倍。为了将这一测定体系用于实际样品的免疫分析,我们还考察了将酶标抗体吸附于固相载体后载体对化学发光的影响。从图3可知,直接法化学发光测定吸附于载体上的酶标抗体,较该法测定溶液中的酶标抗体的灵敏度约降低了8倍,而偶合法化学发光测定的灵敏度仅降低约2倍,在此情况下,偶合法较直接法的灵敏度约高30倍,故偶合化学发光法用于酶联免疫吸附测定时,固相载体不会成为该免疫测定的障碍。3.4甲胎蛋白测定3.4.1线性及检出限按上述实验方法对标准甲胎蛋白稀释液进行测定,求得甲胎蛋白的线性测定范围为0.1～100.0ng/mL,检出限为0.08ng/ml,工作曲线回归方程为ICL=0.174+1.24C,相关系数为0.998。3.4.2测量