生物分子传感器ap合成酶的研究进展

生物分子传感器ap合成酶的研究进展

1生物分子马达的分类生物分子达是将化学能转化为力学能的生物分子。它们广泛存在于细胞中，通常位于纳米规模内，因此也被称为纳米机器。生物分子马达能主动从环境中俘获“能量分子”ATP(adenosinetriphosphate,三磷酸腺苷),借助热涨落来消耗ATP水解所释放出的化学能,进而改变自己的构象。一旦与轨道结合,马达通过构象变换产生与轨道间的相对运动,因此,它们具备“自动性”(motility)。生物分子马达按运动形式可分为线动和转动两大类。线动马达常常与特定轨道结合在一起,利用ATP水解所释放出的化学能产生与轨道的相对运动,其作用机制与人造发动机类似。这类马达主要有肌球蛋白(myosin)、驱动蛋白(kinesin)和动力蛋白(dynein)等;转动马达则类似于人造电机,也由“转子”和“定子”两部分组成,这类马达包括鞭毛马达(flagellar)和ATP合成酶(ATPsynthase)等,它们往往是可逆的。ATP合成酶广泛存在于细菌、叶绿体和线粒体膜上。它由两个转动马达Fo和F1共轴(cn-ε-γ)耦合而成(图1,见封二)。嵌膜部分(疏水)Fo由质子通道(cn)和蛋白a组成;而突出部分(亲水)F1的结构类似于“电机”,其“定子”由三对αβ蛋白环成,γ蛋白则是其“转子”。ATP在F1中的水解是释能反应,它驱动γ轴逆时针转动(自上往下观察);反之,如果外力拖动“转子”顺时针转动,则F1合成ATP。因此F1既是“电动机”又是“发电机”。F1的“定子”通过蛋白组合δb2与Fo的a蛋白紧紧结合在一起。Fo中跨膜质子梯度导致的质子流驱动离子通道cn相对于蛋白a顺时针转动;F1中ATP的自发水解驱动“转子”逆时针转动,这两种反向“自动”又是共轴耦合的,因此,马达是合成酶(发电机)还是水解酶(电动机)完全取决于生化环境。2为什么要研究异质酶？2.1atp合成酶系统ATP是有机组织的“能量货币”。它由腺苷连接三个磷酸基团组成(图2,见封二)。如果最外的磷酸基团(Pi)断裂,剩余的便是ADP,同时释放的磷酸键能(约20kBT)与细胞内各种有序运动每个循环所需能量相当。ATP合成酶的主要功能是将营养因子燃烧所释放出的低能的共价键能量集结到高能的ATP磷酸键上,使ATP、ADP和Pi三分子循环参与所有生命过程。因此ATP的合成机制是人类在揭示生命过程中首先面临的生物能学(bioenergetics)问题。2.2基于atp合成酶的机器转换系统给药人造机器要实现化学能与力学能的转化必须借助中间介质,如热或电,即能量转化是间接的,这就决定了人造机器的能量转化效率是不理想的。ATP合成酶则不同,它将化学反应所释放的化学键能通过自身的构象变化直接转换成力学能,其转换效率接近100%。因此,在机器的能量转化效率方面,ATP合成酶这个现成的力学化学耦合(mechanochemicalcoupling)系统给我们带来很多启示。这也是为什么分子马达的力学化学耦合机制令科学家着迷的原因。2.3adp/pi的含义传统的酶动力学只考虑单个底物的不可逆反应,而ATP合成酶是由两个转动马达耦合而成的可逆酶。当它处在合成酶时,ADP和Pi是底物,ATP是产物;反之,如果工作在水解状态,则ATP是底物,而ADP和Pi是产物。因此,它们既是底物又是产物且结合在同一个位点,其角色互换又与跨膜质子驱动势(proton-motiveforce)的大小有关。这种复杂的酶动力学过程是生物体内普遍存在的,也是我们研究生命科学所必须克服的难题之一。2.4boltzhen模型在传统统计中,一旦我们知道系统的始态和终态能量及连接两态的路径,便可确定系统对外作的功。事实上,两态的能量及系统与环境在路径上的交换热在Boltzmann统计上均有kBT涨落,只是在宏观统计中,这个量级的涨落被忽略了。如果系统很小,这样的涨落则不能被忽略。这类微观系统的统计热力学问题是纳米科学当前所面临的研究障碍。ATP合成酶正是这样的微观系统,它为物理学家解决该问题提供了一个理想的研究平台。3关于pd-反应的重要进展3.1能量货币atp能量分子ATP是由德国科学家KarlLohmann于1929年在肌肉组织中发现的,但它在生命过程中所扮演的角色直到1939～1941年才被逐渐了解;德裔美国科学家FritzAlbertLipmann阐明了ATP是细胞的“能量货币”,其化学能储藏于高能磷酸键中;1948年,英国科学家AlexanderRobertusTodd首次人工合成了ATP;20世纪40～50年代,科学家观察到在细胞呼吸或光合作用期间,线粒体或叶绿体内的ATP浓度明显上升;1960年美国科学家EfraimRacker成功地从线粒体膜上分离出ATP合成酶的突出部分,由于它是首次被定义的与细胞呼吸耦联的因子,因此被命名为F1(factor1);1965年,他和Kagawa又解析出嵌膜部分,并定名为Fo(factorofoligomycin),从此,该马达被称为FoF1ATP合成酶;1957年,丹麦科学家JensC.Skou发现了在活体细胞内维持钠、钾离子平衡起主要作用的离子泵,该泵结构与ATP合成酶类似。3.2跨膜质谱合成衍生物基于有关ATP合成及细胞呼吸之间的关联研究,英国科学家PeterDennisMitchell于1961年提出了“化学渗透假说”(chemiosmotichypothesis),认为是跨膜质子驱动势推动了ATP的合成;1973年,美国科学家PaulD.Boyer等建立了三个β位点的顺序构象变换与ATP合成的关系,即“结合变换机制”(bindingchangemechanism)(图3A、B、C、D),并推测了γ轴的非轴对称性;1994年,英国科学家JohnE.Walker通过晶体结构(图3a、b、c、d)证实了γ轴结构上的非轴对称性,与Boyer分享1997年Nobel奖。3.3tf的“自动性”与荧光单分子检测1990年代以前,对细胞内生物大分子的化学性质的研究均通过系综测量进行,其结果反映的是大量分子的平均行为,而人类对其物理性质的认识仅停留在测序分类和晶体结构之类的静态层面上。我们对于生物分子马达的兴趣点是它们的“自动性”,即它们是如何启动、运动和发力、以何种方式沿轨道运动、每个运动周期消耗多少燃料、效率如何等,要回答这些问题必须借助20世纪80年代发展起来的单分子操纵(manipulation)和实时视见(visualizing)技术,例如原子力显微镜(AFM)、光镊(opticaltweezers)、流场拖曳(hydrodynamicdrag)、磁钳(magnetictweezers)、玻纤微管(glassmicropiptte)、荧光共振能量转移(FRET)、及荧光单分子检测(fluorescencesingle-moleculedetection)等。这些技术既可探测0.1～100nm的位移,又可对单个马达施加0.1～104pN的外力。在F1“自动性”(ATP水解)的单分子研究方面,突破性进展大部分是由日本早稻田大学的Kinosita小组作出的。1997年,他们实时视见了F1在ATP溶液中自发转动(图4,见封二)(这种“自动”在1998和1999年也相继被德国Junge和日本Futai小组借助不同的方法观察到);1998年,他们又发现这种转动是“步进”的,每步转过120°;2001—2004年,他们进一步观测到120°的步进包含着80°和40°两个分步,同时证实是第三个位点的核苷结合推动了γ轴的转动;2007年,他们用磁镊结合全内反射荧光显微术(TIRF,图5,见封二)确认了磷酸根的释放是个力学过程(图6),这一过程伴随着40°分步。该实验同时证实了带荧光分子的核苷从结合到释放需要经历240°转动,即两步(图7)。在F1的“被动”实验方面,2004年,他们和德国Graber小组分别用磁钳和质子梯度钳(ΔpHclamp)在体外实现了ATP的合成。在Fo的动态研究方面,2005年,我国乐加昌小组测量了质子驱动势作用下Fo产生的扭矩。这些单分子实验给出了生物分子实时的行为与性质。3.4膜质热学酶学研究上述研究主要集中在分离的F1部分,利用的是其水解的“自动性”。而作为一个完整的全酶,其工作机制还涉及到跨膜质子驱动势。1990年以来,Graber、Rumberg和Strotmann小组先后测量了从菠菜叶绿体中分离出来的ATP合成酶(CFoF1)的全酶动力学,发现ADP和Pi的米氏常数同时随跨膜质子梯度的上升而下降。他们先将CFoF1重组到磷脂膜上(图8),并使用一种精巧的质子梯度钳技术。2007年,舒咬根等提出了力学化学紧耦合模型,并解析了该马达的酶动力学。根据上述实验结果,该模型排除了ADP和Pi有序结合的可能性,获得了该可逆马达的“相图”(图9,见封二)。3.5cfof1的整理在马达的整体结构图像方面,2000年,Graber小组用电境测得了CFoF1的全貌(图10,见封二)。在质子通道数的测定方面,1999和2000年,Walker小组和德国Muller小组分别测得EFo(大肠杆菌)和CFo的质子通道数依次为10和14(图11,见封二)。4纳米生物机器系统的应用意义21世纪是纳米科技的世纪。高集成、智能化纳米器件的开发必将推动信息技术、生物技术、新材料技术、能源技术及环境技术等的高速发展。纳米技术是目前国际科技竞争的前沿,也是对未来社会发展、经济振兴、国力增强最有影响力的战略研究领域。人工纳米机器的构建与应用是此前沿领域国际上最具有挑战性的热点课题之一。21世纪也是生命科学的世纪。生命活动是自然界最精巧的运动方式,它赖以存在的基础是生物大分子能够响应外界刺激(包括环境及外场条件的改变)。近20年来,分子生物学和单分子生物物理学所取得的突破性进展揭示了生物分子马达在生命过程中扮演着核心角色。这些过程包括ATP合成,基因转录、翻译,物质输运,细胞运动与分裂等。因此,科学界已全面确立了将蛋白酶理解为生物单分子机器的观点。生物分子马达的发现一方面使人们对生命的复杂有序有了新的认识,另一方面也启示和激发科学家去建造能与自然相媲美的纳米机器。生物分子机器是上亿年进化的产物,尺寸大多在几个纳米到几百个纳米之间,其结构、动态与功能的关系为人工纳米机器的设计和制备提供了绝佳的范例和素材。人们可以直接利用天然蛋白质酶为材料构建能够实现能量转换的分子机器以满足实际需求。通过研究各种纳米生物机器物理化学过程,尤其是纳米尺度的物理、化学作用的特殊性(如热涨落的重要性等),人们可以探索纳米生物机器的普遍运动规律,并有可能衍生新的物理概念。这些新概念可指导人们找出优化设计原则,进而引导人工纳米机器的构建与应用,其作用不亚于卡诺热机模型对工业革命的影响。对纳米生物机器系统的研究不仅对我们了解生命的奥秘、构建人工纳米机器及机器人系统有着重要意义,还将为智能材料体系的设计、构造,生物传感器以及传统生物芯片产业的改造和升级换代提供理论和技术基础。开展纳米生物机器运动机理与应用研究有利于保持我国在此领域的国际竞争力和抢占国际纳米技术发展的制高点,对发展具有自主知识产权、对国民健康及国防建设具有重要应用价值的纳米生物技术也将起到关键性作用。ATP合成酶是自然界最精妙的纳米机器之一,有关它的研究已经产生了六位Nobel奖得主,其重要性不言而喻。发达国家对该马达的研究是系统的:Boyer、Cross和Senior等小组的研究侧重于生化方面;Walker小组垄断了F1各部件的晶体结构;而Kinosita小组又几乎主宰了F1单分子行为的检测[24,27,28,29,30,31];在全酶动力学测量方面,Graber、Rumberg和Strotmann三小组无疑已走在世界前列,他们能在磷脂膜上重组该马达并发展出一种精巧的质子梯度钳技术。尽管如此,人类对ATP合成机制的了解还非常肤浅,其中对F1的理解还停留在唯象层面,对Fo的认识则仍处在卡通阶段。我们面临的主要问题如下:(1)如何获得Fo的精细结构图像;(2)质子通道c环与蛋白a之间的相互作用机制;(3)质子流向与马达转向的对应切换机制;(4)“转子”γ轴的储