白三叶草褐纹斑病病原菌束状漱赤霉的分离鉴定及生物学特性研究

白三叶草褐纹斑病病原菌束状漱赤霉的分离鉴定及生物学特性研究

三叶草是优良的多年生大豆草。它在欧洲广泛分布，并在中国北方和南方的许多地区分布。白三叶草在中国一直作为牧草,近几年随着城市化进程的加快,尤其随着立体绿化新概念的提出,三叶草作为草坪草逐渐得到人们的认可,栽培面积迅速增加。但由于三叶草幼嫩多汁,枯草层厚,因而适宜多种病害的发生。据资料统计,白三叶草的病害一直是其生长的重要威胁,造成其减产和品质降低,给农业和农村经济造成巨大损失。目前,中国已发现的三叶草病害有10余种,其中真菌性病害约占2/3。匍柄霉叶斑病可引起白三叶草叶片大量枯死和脱落,病原菌可随种子进行传播,严重影响牧草的收割和种子质量。而对白三叶草匍柄霉叶斑病菌的培养性状及其生物学特性的研究国内还没有系统的报道,目前研究内容多集中在病害的调查和防治方法上。为此,本文对白三叶草匍柄霉叶斑病病菌进行分离、鉴定及生物学特性的研究,为更有效的防治该病害提供理论依据。1材料和方法1.1材料表面白三叶草匍柄霉叶斑病样品于2009年3月采自沈阳农业大学草坪苗圃。采用常规组织分离方法进行病原菌的分离、培养和纯化。1.2疾病、疾病和疾病的症状和特征的描述1.2.1疾病症状描述根据白三叶草褐纹斑病叶部症状特点进行描述。1.2.2内加酵剂形态观察选取带有白三叶草褐纹斑病典型症状的植株叶部材料,采取叶面病原菌直接挑取法,在光学显微镜下直接检视,进行病原菌形态观察。通过常规组织分离法,在PDA上分离获得病原菌的纯培养物,进行病原菌的形态描述。1.3关于病原体的生物学特性的研究分别进行不同培养基、温度、pH值、光照和致死温度等特性的测定。1.3.1菌种培养基制备病原菌菌丝生长测定选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)、查氏培养基(Czapek)、燕麦培养基(OA)、麦芽浸膏琼脂培养基(MEA)、玉米粉琼脂培养基(CMA)、胡萝卜琼脂培养基(CDA)、胰蛋白胨酵母葡萄糖琼脂培养基(PCA)、水洋菜培养基(TWA)等9种不同培养基。制取直径4mm的病菌菌饼,接种于上述培养基上,设3个重复,于25℃恒温培养。7d后分别测量并记录菌落直径,绘制菌落生长曲线,进行方差分析和多重比较。1.3.2病原菌分生孢子萌发测定以燕麦培养基作为基础,将葡萄糖、果糖、D-甘露糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖及可溶性淀粉7种碳源均以20g·L-1量分别加入,配制成各种碳源培养基,以燕麦片培养基为对照。制取直径4mm病菌菌饼,接种于上述培养基上,设3次重复,于25℃恒温培养。测7d菌落直径,观察菌落生长速度和稳定性,绘制菌落生长速度曲线,进行方差分析和多重比较。病菌分生孢子萌发测定分别选用1%的葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖和可溶性淀粉7种培养液,在这7种培养液中将分生孢子配成悬浮液,其浓度为10×镜头下孢子数20个/视野(下同)。采用载玻片萌发法,置于25℃条件下保湿培养,每处理重复3次。6h后测定孢子萌发率。1.3.3生长速度曲线测定燕麦培养基作为基础培养基,将硝酸钾、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸分别按0.5%的量加入上述各种氮源,配制成各种氮源培养基。以燕麦片培养基为对照。测7d菌落直径,绘制菌落生长速度曲线,进行方差分析和多重比较。选用供试培养液8种:1%丙氨酸、1%氯化铵、1%硫酸铵、1%(NH4)2SO4、1%硝酸钾、1%甘氨酸、1%精氨酸和1%NaNO3,配置孢子悬浮液,采用培养皿保湿法,重复3次。处理6h后测定孢子萌发率。1.3.4菌落培养与直径将直径4mm的菌饼接种于OA平板上,分别于5,10,15,20,25,30,35℃培养,每次重复3次,每24h测量菌落直径。采用载玻片萌发法将孢子悬浮液滴于载玻片上,分别于5,10,15,20,25,30,35℃下保湿培养,每次重复3次,24h后检查孢子萌发率。1.3.5生长曲线测定将直径4mm的菌饼接种于燕麦培养基上,于25℃下将其分别进行光照24h、黑暗24h、L/D=12h/12h共3个处理,每处理重复3次。每24h观察并记录菌落直径,7d后绘制菌丝生长曲线,进行方差分析和多重比较。采用载玻片萌发法,将分生孢子悬浮液滴于载玻片上,分别进行光照24h、黑暗24h、光照/黑暗=12h/12h共3个处理,每个处理重复3次。6h后检查孢子萌发率。1.3.6生长曲线分析将直径4mm的菌饼接种于pH值分别为4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0和11.0的燕麦培养基上(用0.1%的NaOH和HCl溶液调配),每个处理重复3次,25℃恒温培养。每24h观察并记录菌落直径,7d后绘制菌落生长曲线,进行方差分析和多重比较。采用凹玻片悬滴法,以无菌水为缓冲液,用0.1%的NaOH和HCl溶液调配出pH值分别为4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0和11.0的孢子悬浮液,置于25℃条件下保湿培养,每个处理重复3次。6h后检查孢子萌发率。1.3.7燕麦生长曲线测定将直径4mm的菌饼置于装有无菌水的试管中,每管10枚菌饼,将试管分别置于30,35,40,45,50,51,52,53,54,55,60,65℃恒温水浴中加热处理10min后迅速冷却,然后每试管中随机取出5枚菌饼,置于燕麦培养基上,25℃下暗培养7d,观察其有无菌落生长。将每个试管中倒入5mL的孢子悬浮液,分别放入30,35,40,41,42,43,44,45和50℃的恒温水浴锅中加热10min后迅速冷却,再将不同处理的孢子悬浮液于载玻片上25℃保湿培养,6h后检查孢子萌发情况。2结果与讨论2.1疾病、疾病和疾病的症状和特征的描述2.1.1近圆形病斑白三叶草褐纹斑病主要危害叶片,病菌从叶尖、叶缘及叶面均可侵染,产生病斑。感病初期为褪绿褐色针尖大小的斑点,多渐扩大成近圆形病斑,偶呈不规则形状,病斑直径多为1.3～4.5mm×1.5～3.6mm;随着病斑的发展,逐渐变为灰褐色至黄褐色,边缘深褐色至黑褐色,病健交界清晰可见。发病严重时,病斑扩展迅速,病斑可相互愈合呈不规则的大斑,发病盛期,叶片大量失水枯死乃至脱落。后期在病斑上长出深褐色的分生孢子堆,呈同心轮纹状排列,此为本病的典型症状。2.1.2willh.型病原菌白三叶草褐纹斑病的病原菌为无性型真菌,匍柄霉属,束状匍柄霉Stemphyliumsarciniforme(Cav.)Wiltsh.。病原菌在PDA上,菌落平展,圆形,墨绿色,戎状,菌落背面近黑色。分生孢子梗单生或束生,直立褐色,具2～4个横隔,大小为16～32μm×6～8μm,顶部膨大。分生孢子单生于梗上,近圆形、卵形或长椭圆形,深褐色至黑褐色,壁光滑,有纵横隔膜,砖格分隔处明显缢缩,大小为18～38μm×18～29μm。2.2关于病原体的生物学特性的研究2.2.1培养基上的生长速度病菌菌丝在OA培养基中生长最快,其次为PCA、CDA、CMA和PSA培养基,而在PDA、TWA和Czapek培养基上生长速度较慢,Martin培养基上生长速度最慢。从菌落颜色、形态和生长速度看,病菌在不同培养基上均可生长,但存在较大差异。在OA、PCA、CMA、PSA、PDA和CDA培养基上菌落较为致密,在Czapek、TWA和PDA培养基上菌落较为稀疏(见表1)。2.2.2病原菌病原菌对碳源的要求病菌在果糖培养基上菌落长势最好,D-甘露糖、葡萄糖、乳糖无明显差异,效果次之。菌丝在不同碳源条件下的生长情况差异不显著(见表2),说明病菌菌丝对碳源无特异要求。处理6h后,在7种不同碳源培养液中分生孢子均有不同程度的萌发,在葡萄糖培养液中,萌发率最高,在蔗糖中萌发较差,其影响结果如图1。2.2.3氮源对菌落生长的影响病菌适宜氮源为硝酸钾和甘氨酸,其中最适氮源为硝酸钾。氮源为精氨酸和氯化铵时生长均很缓慢,在氮源为硫酸铵条件下菌落生长最慢。菌丝在不同氮源条件下的生长情况存在显著性差异(见表3)。处理6h后,在7种不同氮源培养液中分生孢子均有不同程度的萌发,在清水与丙氨酸培养液中,萌发率最高(如图2)。分生孢子在1%甘氨酸、硝酸钾、硫酸铵和硝酸钠溶液中萌发较好,在精氨酸和氯化铵中萌发较差,说明孢子萌发对氮源有特殊要求。2.2.4不同温度下病原菌生长情况病菌菌丝在5～30℃范围内均可生长,适宜温度范围为20～30℃,最适温度为25℃。在5～10℃期间生长十分缓慢;35℃下不能生长。菌丝在不同温度下生长情况存在显著性差异(见表4)。培养6h后测定,分生孢子在温度10～35℃范围均可萌发;适宜温度为25℃,此温度与菌丝生长的适宜温度要求基本相同。试验结果还表明,分生孢子在低于5℃不能萌发,35℃时萌发率较低,说明低温和高温对孢子萌发均具有明显的抑制作用(如图3)。2.2.5最适生长ph值病菌在pH值4～10范围内均可生长,但不同pH条件下菌丝生长差异明显。在pH值6～8时,菌落扩展最快,菌落生长致密,最适pH值为8。菌丝在不同pH值下的生长存在显著性差异(见表5)。病菌分生孢子在pH值4～11均可萌发,在pH值7～9条件下萌发迅速,且萌发率高,pH值为7时萌发率达99%(如图4)。2.2.6半光照条件下的菌落生长情况光照对菌丝的生长没有明显的作用,菌丝在光照和半光照条件下比全黑暗条件下的菌落直径稍大一些,菌落更致密一些(如图5)。光照对孢子萌发的影响较小,孢子萌发对光照的反应较不敏感。2.2.7致死温度1.2经≥55℃的几个温度处理后,都无菌丝生长,由此明确该菌