弓形虫prognumljh1型和h2型细胞感染小鼠后的动态变化

弓形虫prognumljh1型和h2型细胞感染小鼠后的动态变化

弓虫是一种由人类和动物感染的细胞内寄生虫。近年来,随着医源性免疫抑制、器官移植以及艾滋病患者的增多,弓形虫病的发病人数也在逐渐增多,并常常造成致死性损害。弓形虫感染后对宿主的损害与宿主的免疫状态密切相关。因此感染弓形虫后宿主的免疫机制的研究日益受到重视,其中一直被认为是机体抵抗弓形虫感染的细胞免疫的机制十分复杂,包括多种免疫细胞和免疫因子的参与及其相互作用。本研究首次研究了脾脏CD4+CD25+调节性T细胞在弓形虫成囊株感染弓形虫宿主体内的变化规律,并与宿主感染后Th1和Th2的变化规律相结合,以探讨弓形虫感染后引起的免疫抑制的机制。材料和方法一、动物、药物和试剂1.弓形虫虫株:弓形虫Pruguniaud成囊株由蚌埠医学院孙新教授惠赠并由本实验室传代保种。2.实验动物:雌性清洁级ICR小鼠(体重24~26g)30只,购自扬州大学比较医学中心,许可证号为SCXK(苏)2007-0001。小鼠常规饲养,自由采食和饮水。3.主要试剂:CD3-PE-Cy5、CD8-FITC、IFN-γ-PE、IL-4-PE单克隆抗体,BrefeldinASolution,MouseRegulatoryTCellStainingKit,购自美国eBioscience公司;弗波脂(PMA)、离子霉素(Ionomycin)购自美国Sigma公司。二、流式胞内因子检测1.包囊的获取方法:感染Prugniaud株用于保种的小鼠经颈椎脱臼法处死取小鼠脑,在加有生理盐水的匀浆器内制备成脑组织匀浆,然后向脑组织匀浆中加入生理盐水至5ml,移至15ml普通离心管中,用直吸管自底缓缓加入等体积的淋巴细胞分离液,使组织匀浆浮于分离液之上,3500r/min离心30min,吸取最底层沉淀,用生理盐水恰当稀释后置显微镜下计数包囊,留待感染动物用。2.建立弓形虫慢性感染动物模型:购买的小鼠饲养3d后,腹腔接种弓形虫,剂量为每只小鼠10个弓形虫包囊(约0.1ml)。3.小鼠脑组织匀浆的制备:感染后各试验组的小鼠颈椎脱臼法处死后,取整个小鼠脑,矢状切后,其中一半保存于10%甲醛中用于做病理切片,另外一半置于匀浆器中,并向匀浆器中加1ml生理盐水,在匀浆器中轻轻研磨小鼠脑组织至成较均匀糊状后转移到干净的Eppendorf管中,用生理盐水恰当稀释后显微镜下计数包囊。4.单个核细胞悬液的制备:在平皿中加入含1%小牛血清的PBS液,放入2张200目的尼龙膜,将脾组织置于两层尼龙膜之间,用注射器内芯研磨脾脏组织,将细胞悬液转移到15ml离心管中,1500rpm4℃离心5min,弃上清。以1ml含1%小牛血清的PBS重悬细胞沉淀,加入5~10ml的红细胞裂解液,室温静置5min,再1500rpm4℃,离心5min。弃上清。用含1%小牛血清的PBS洗涤细胞,用尼龙膜过滤细胞碎片,离心,完全RPMI1640重悬细胞,计数备用。5.流式胞内因子检测:将单个核细胞悬液稀释至2×106/ml,按工作浓度加入弗波脂(PMA)25μl,离子霉素(Ionomycin)20μl,阻断剂BFA3.3μl后在37℃5%CO2孵箱中孵育4~6h,离心重悬加入CD3-PE-Cy5、CD8-FITC室温避光孵育15min后再加入Fix&Perm中的ReagentA(固定液),室温避光孵育15min。加PBS离心后弃上清,加Fix&Perm中的ReagentB(破膜和溶血液),同时各管加入相应胞内因子抗体IFN-γ-PE、IL-4-PE。室温避光孵育15min后加PBS离心弃上清,0.5mlPBS重悬上机检测。6.流式染色CD4+CD25+FoxP3+TregT细胞比例检测:将制备的单个核细胞悬液,按试剂盒说明书进行操作。7.小鼠脑组织病理切片的制备:小鼠脑组织常规固定,包埋,切片,HE染色,拍照。结果一、弓箭昆虫感染小鼠的一般情况弓形虫感染后1w左右小鼠会出现竖毛、怕冷、腹痛、进食减少等弓形虫急性感染症状,约3~4d度过急性期后状态转好。二、小鼠红细胞分离液感染后形态变化小鼠慢性感染弓形虫后第2w小鼠脑组织匀浆就可发现包囊形成。包囊经淋巴细胞分离液纯化后形态典型,如图1。包囊大小和数量在感染后同组内不同小鼠间差异较大,且与感染的时间无关。前人也曾研究过弓形虫感染后肠道损伤与弓形虫在体内的繁殖情况没有很大关系而是免疫平衡所引起的。三、th2型细胞在小鼠慢性感染弓形虫感染后th1小鼠感染弓形虫后,Th1型细胞比例在第1w出现一过性降低,第2w急剧升高,进入慢性感染期后又有所下降。Th2型细胞在第1w升高明显,从第2w开始下降,到第5w又开始升高。CD4+CD25+T细胞在感染后第1w达到整个试验过程中的高峰,第2w开始下降,到3w以后趋于稳定。见表1。小鼠慢性感染弓形虫后,Th1型细胞比例在急性感染期一过性降低,后急剧升高,进入慢性感染期后又有所下降。Th2型细胞整个试验过程中呈现和Th1型细胞大致相反的变化趋势。CD4+CD25+T细胞在急性感染期,呈现和Th1型细胞相反的比例变化。三者之间的比例变化的比较见图2。四、包囊形成的病理病理意义从感染后不同周次小鼠脑组织的病理变化可知,在急性感染期(感染后1W),小鼠的脑组织病理损伤并不是很严重,随着感染期的延长,虽然小鼠的症状可能减轻,病情趋于稳定,但脑组织病理切片中仍可有脑组织的较严重的组织水肿和血管充血。如图3,可能随着包囊形成后时间的延长,这些病变可能逐渐恢复。这种病理变化与临床表现的不一致性可能也是与机体的免疫平衡有关。弓形虫感染后机体免疫抑制的机制许多病原体在感染过程中都会诱导机体产生免疫抑制状态,这不仅是病原体逃避宿主免疫应答的适应性机制,还可以防止机体在抗感染过程中由于产生过强的免疫应答而导致严重的病理损害。研究发现,在刚地弓形虫感染过程中,机体会产生短暂的免疫抑制,表现为脾淋巴细胞对弓形虫抗原或有丝分裂原刺激的应答能力明显减弱[2~5],但对于产生免疫抑制的机制还有待深入研究。自1995年,Sakaguchi等首先发现将去除了CD4+CD25+组分的T细胞转移到裸鼠体内会引发多种自身免疫性疾病,而同时输入CD4+CD25+T细胞则可抑制疾病的发生。随后在体外研究也发现CD4+CD25+T细胞具有低反应性和免疫抑制功能,自此有关CD4+CD25+T细胞的研究得到迅猛发展,并视其功能将CD4+CD25+T细胞作为调节性T细胞或抑制性T细胞的代名词。近年来越来越多的证据表明,CD4+CD25+T细胞在调节病原体感染免疫中起重要的作用。研究发现,它们是正常动物体内业已存在的细胞亚群,在一定程度上通过限制对感染位置的免疫应答的敏感性来抑制过度的免疫应答,导致病原体的长期存在。在硕大利什曼原虫感染中,CD4+CD25+调节性T细胞可通过抑制易感鼠Th2应答或是抗性鼠的Th1应答可使机体避免产生过强的免疫反应,也可使寄生虫易于存活。弓形虫和利什曼原虫同为胞内寄生的原虫。本实验室在工作中已观察到Prugniaud成囊株弓形虫感染ICR小鼠后,小鼠经过急性反应期后可进入慢性感染状态,弓形虫包囊可在小鼠体内长期存活,可能也与弓形虫感染后诱导宿主免疫抑制状态有关,因此成为研究病原体感染机体后诱导机体产生免疫抑制状态而逃避宿主免疫应答得以存活有关机制的良好模型。由于CD4+CD25+调节性T细胞具有的免疫抑制功能,因此检测成囊株弓形虫感染后机体CD4+CD25+调节性T细胞的动态变化及其与Th1型和Th2型T细胞亚群比例变化的关系有助于分析弓形虫感染后诱导宿主产生的免疫抑制。本研究以ICR小鼠为研究对象,稳定地建立了弓形虫成囊株感染的动物模型,并采用可有效地在单细胞水平研究细胞因子的胞内因子流式检测法检测弓形虫感染小鼠脾单个核细胞中Th1和Th2型细胞及调节性T细胞比例的动态变化。结果显示出宿主感然弓形虫后,机体经过短暂的免疫下调后,会出现一个很强的Th1型的免疫应答,研究结果与前人研究一致,由于Th2与Th1相拮抗,整个实验过程中大致呈现和Th1相反的变化趋势。比较有意义的是CD4+CD25+T细胞在整个实验中的高峰期却是急性感染后Th1短暂免疫下调期。已有实验表明,急性弓形虫感染和慢性弓形虫感染细胞因子的表达有所不同。慢性弓形虫感染可诱导高水平的IFN-γ和IL-2等Th1型细胞因子的表达,而急性弓形虫感染则表现出免疫抑制。本实验利用成囊株弓形虫Prugniaud株,感染宿主经过急性期可进入慢性感染,其细胞亚群的变化与前人实验较一致。鉴于本研究中CD4+CD25+调节性T细胞与Th1与Th2变化之间的趋势关系和本实验中急性感染期小鼠脑组织病理切片可以推测,弓形虫感染宿主后没有发生过强的免疫应答导致严重的病理损伤原因之一可能是由于CD4+CD25+调节性T细胞的参与而出现了免疫抑制。而从使小鼠在症状比较明显的情况下,小鼠的脑组织并没有特别严重的损伤,小鼠可以度过急性期进入慢性感染阶段。由于相对高比例的CD4+CD25+调节性T细胞和低比例的Th1型T细胞出现在弓形虫急性感染期。且国内已有文献报道,宿主感染强毒株RH株弓形虫后,脾脏CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的比例显著增高。我们也推测RH株弓形虫之所以与成囊株弓形虫不同,能够在宿主体内大量繁殖且难以形成包囊的原因之一可能与RH株弓形虫感染宿主后高比例的CD4+CD25+调节性T抑制Th1型细胞分化和分泌高活性的IFN-r的细胞因子有关。而且已有试验证实,感染鼠若给予外源性IFN-γ能增强其保护性免疫。通过本次实验,对不同细胞亚群及细胞因子在弓形虫发