穿心莲内酯磺化物防治手足口病的机制研究

穿心莲内酯磺化物防治手足口病的机制研究

71肠道病毒（hfdd）是71型肠道病毒科的成员。这是严重的手足语言疾病（hfd、fotig和movement，hfsd）的主要病原体。近年来，hfdt在中国大陆引起了流行，并受到了严重损害。EV71常引起5岁以下的婴幼儿感染发病,呈现手、足、口和臀部的疱疹,多数患儿不治自愈,然而极少数会造成中枢神经系统感染,引起脑干脑炎、急性驰缓性麻痹、神经源性肺水肿等严重并发症,致残率和致死率很高。初步的病理学证据表明,过量的病毒增殖和过激的炎症反应可能是造成HFMD重症病例难治的根本原因。目前,临床上缺乏特效的HFMD治疗药物,对于HFMD危重病人,一般需要对症治疗,才能度过危险期,此类药物至今尚缺乏有效性的循证医学证据。现在,用于临床治疗EV71感染的药物,主要是抗病毒药物,以利巴韦林、阿昔洛韦、更昔洛韦、干扰素、特异性免疫球蛋白为代表;通过抑制炎症和调节免疫来达到治疗危重症HFMD的药物极少且存在争议,包括激素、炎症因子抗体和中草药。当然,实验室也筛选到很多抗病毒药物,包括中草药提取物、RNAi等,但距离临床应用尚远。EV71感染不同种类细胞和动物造成的HFMD模型是防治药物筛选和致病机制探索的基础。目前EV71感染模型主要有RD、Vero、THP-1、SK-N-SH等体外细胞模型和乳鼠、乳猴等体内动物模型,尤以EV71感染乳鼠模型研究最为深入,已有不同EV71毒株致死1日龄、2日龄、3日龄、7日龄、10日龄等乳鼠模型用于疫苗评价、药物筛选和机制探索等方面,但这些模型在炎症因子风暴、免疫细胞失常、组织病理损伤等方面的代表性值得商榷,还无法获得典型的神经源性肺水肿动物模型。穿心莲内酯是中药穿心莲的主要有效成份之一,除具有清热解毒、消炎燥湿的传统功效之外,最新研究表明,还具有抗病毒、免疫调节等功能。穿心莲内酯磺酸钠是具有水溶性的穿心莲内酯衍生物(商品名:喜炎平注射液),具有很高的抗炎和调节免疫活性。国家中医药管理局根据传统中药治疗瘟病理论,推荐临床使用喜炎平注射液治疗HFMD,在中国大陆得到普遍应用,初步临床应用结果表明具有一定的疗效,然而,尚缺乏高质量的大规模的循证医学证据和实验室试验依据,其用药剂量、时机等需要进一步明确,其作用机制也有待阐明。本研究对前期建立的EV71BJ09/07感染Vero细胞模型和7日龄ICR乳鼠重症HFMD模型进一步优化后,对喜炎平注射液防治EV71感染的量效和时效进行了探索,并对发挥保护效应的作用机制进行了初步探讨,为喜炎平注射液治疗重症HFMD提供了实验室试验证据。1材料和方法1.1实验动物SPF级7日龄ICR乳鼠,购自军事医学科学院实验动物中心。实验动物的饲养和使用按照军事医学科学院的相关规定进行。1.2细胞库atccVero细胞(Africangreenmonkeykidneycells,ATCC誖Number:CCL-81TM),来自军事医学科学院微生物流行病研究所细胞库。细胞培养基为M199培养基,购自Gibco;胎牛血清购自Novogen。1.5内包磺化物cc50和mld的测定1.7病毒组织负荷检测、血清和组织均匀污泥的炎症分子检测1.8免疫细胞流式细胞培养试验参照文献进行。取感染后第6天的小鼠脾脏,分离脾脏淋巴细胞并常规染色,使用流式细胞仪BDFACSCalibur进行检测。1.9动物组织病理学检查感染后第6天取乳鼠肌肉组织和脑组织,在10%福尔马林中固定48h后,送军事医学科学院疾病预防控制所进行病理检测。1.10sds-东南角电泳利用天津市灏洋生物制品科技有限责任公司生产的中性粒细胞分离液,按照说明书分离感染后第6天乳鼠外周血中性粒细胞,以RIPA裂解液裂解后,进行SDS电泳,并转纤维素膜,常规进行WB检测,一抗稀释比例如下:1∶4000ERK、1∶2000JNK、1∶2000pERK、1∶2000p-JNK、1∶200p65、1∶5000β-actin,过氧化物酶标记二抗1∶1000稀释,ECL曝光扫描后Gel-Pro3.2软件处理,β-actin浓度作为内参。1.11统计分析使用GraphPadPrism5进行数据分析和作图。数据以均数±标准差表示,以P<0.05判定为差异具有统计学意义。2结果2.1对veo细胞和7日龄icr乳鼠的毒力新建EV71-BJ09/07毒株病毒库在Vero细胞和7日龄ICR乳鼠的毒力分别为1.25×108CCID50/ml和10LD50/ml。2.2o细胞财务共享喜炎平注射液对Vero细胞的CC50(图1)约为750μg/ml,在对Vero细胞无毒的质量浓度下,对EV71BJ09/07无抑制作用(图2)。喜炎平注射液对7日龄ICR乳鼠的CC50(图3)约为1500mg/(kg·day),在对乳鼠无毒的质量浓度下,对EV71BJ09/07无抑制作用(图4)。2.3乳鼠临床体征改善情况腹腔注射1.25×107TCID50EV71BJ09/07于7日龄ICR乳鼠是较为稳定的重症HFMD模型,乳鼠发病率100%,生存率稳定在25%~35%。在第1轮试验中,与生理盐水对照组相比较,从第4天起开始用药治疗组明显改善了乳鼠的临床体征,乳鼠体重稳步增长,症状明显减轻,死亡率显著下降;而从第1天起开始用药治疗组乳鼠的临床体征稍有改善,但无统计学差异;从第7天起开始用药治疗组乳鼠的临床体征无明显改善;在第2轮试验中,与生理盐水对照组相比较,10mg/(kg·day)治疗组乳鼠临床体征明显改善,发病症状明显减轻,死亡率下降显著;而1mg/(kg·day)治疗组乳鼠临床体征改善不明显,发病症状和死亡率改变无统计学意义;30mg/(kg·day)治疗组乳鼠临床体征恶化,发病症状加重,死亡率上升。为此,以后的试验中,我们选择喜炎平注射液治疗时机是从感染后第4天开始,剂量是10mg/(kg·day),用药至感染后第10天,在此条件下,喜炎平注射液能使EV71感染乳鼠体质量持续上升(图5a),临床症状明显减轻(图5b),死亡率显著下降(图5c)。2.4ev21感染乳鼠脑、肌肉组织损伤、炎性细胞浸渍取感染后第6天乳鼠脑和肌肉组织进行HE染色,病理结果表明,与生理盐水对照相比较,经喜炎平注射液治疗后,EV71感染乳鼠脑、肌肉组织损伤、炎性细胞浸润明显减轻(图6)。2.5不同浓度喜炎平注射液对乳鼠炎症反应的影响炎症分子检测结果显示,与生理盐水对照相比较,经喜炎平注射液治疗的乳鼠血清、肌肉研磨液的IL-6(图7a)、TNF-α(图7b)、MCP-1(图7c)含量显著下降,表明喜炎平注射液显著地降低了乳鼠的炎症反应。2.6术中b细胞活性检测获得性免疫发挥重要的抗感染作用,免疫细胞流式细胞术检测结果(图8)表明,经喜炎平注射液治疗的乳鼠无论是T淋巴细胞的比例还是T淋巴细胞的活性均比生理盐水对照有显著提高,而B淋巴细胞的活性未有明显改变。3用药时机和剂量EV71感染一般引起轻症HFMD,不治自愈,但近年来,亚洲地区HFMD猖獗,仅2010年中国大陆HFMD发病1774669例,死亡905例。重症HFMD的致病机制至今仍未阐明,严重阻碍了治疗药物的开发。对临床重症HFMD患儿的病理学研究表明,病原体的大量增殖和过激的机体炎症反应是造成机体组织损伤的两大因素,这在乳鼠动物模型中也得到了证实。目前,临床上对重症HFMD的治疗,偏重于抗病毒药物和维持特定器官机能状态的对症治疗药物。实验室筛选的HFMD治疗药物,也多属于抗病毒药物,仅有极少部分为免疫调节性药物,这与重症HFMD免疫致病机制不明密切相关,目前的机理研究仍无法提供特异性治疗的关键靶标。而临床上广泛使用的中草药,作用机制偏重于抗炎和免疫调节,临床研究过程中,多因为伦理学问题,无法找到合理的对照组,或者因为必需与其它药物合用,干扰中草药的药效评定,从而难以获得高质量的循证药效学依据。穿心莲内酯为中草药穿心莲的主要成份之一,已广泛运用于细菌性、病毒性疾病的治疗。穿心莲内酯磺化物为穿心莲内酯的衍生物之一,商品名为喜炎平注射液,国家中医药管理局根据中医瘟病理论推荐喜炎平注射液治疗HFMD,目前已广泛应用于临床。小规模的临床试验表明具有一定的减少发热时间、出疹时间、疱疹愈合时间和痊愈时间等功效,但缺少高质量的大规模临床试验研究资料和实验室试验资料证据,尤其缺乏用药时机和剂量的依据。本研究利用已经建立的EV71感染ICR乳鼠模型,对治疗重症HFMD的用药时机和剂量进行了摸索,并初步揭示了其保护作用主要是通过抗炎和调节免疫作用,而不是通过抗病毒效应,这在EV71感染Vero细胞模型上也得到了证实。大量的抗感染免疫研究资料证实,在感染初期,适度的炎症反应有助于天然免疫的激发和获得性免疫的建立,但感染进入中后期,过量的炎症反应却造成机体的免疫损伤,尤其是炎症因子风暴,造成机体免疫失调,导致不同器官和组织的功能紊乱,使病情迅速恶化,往往造成不可逆转的免疫组织损伤,甚至死亡。本研究中,感染后第4天用药,不破坏感染初期的炎症反应,却显著降低了中后期的炎症因子风暴对机体的损伤,发挥了最大的治疗效果。与第4天用药相比较,第7天用药,由于机体的损伤已经形成,所以喜炎平注射液的药效难以呈现,与对照组无统计学意义;而第1天用药,虽然显著降低了炎症反应,但由于可能破坏了天然免疫的激发和获得性免疫的建立,所以对重症HFMD的治疗效果并不佳,这与IL-6抗体治疗HFMD的情况相一致。由于药物本身具有一定的毒性,在重症病人中由于机体器官机能下降,药物可能对机体的损伤作用更大,合适的用药剂量成为不容忽视的问题。本研究中,10mg/(kg·day)治疗发挥了最大的保护效果,在此剂量下,药物对发病机体的毒性效应很低,表现出最大的药效作用,对比而言,50mg/(kg·day)治疗对发病机体的毒性效应较大,呈现出病情恶化的迹象,而1mg/(kg·day)治疗对发病机体虽无毒性效应,但难以发挥最佳的抗炎和免疫调节作用,表现出重症HFMD乳鼠临床病征减轻,但无统计学意义。临床上,重症HFMD患儿表现出炎症因子风暴效应,这在乳鼠动物模型中也得到了体现。大量临床研究证实喜炎平注射液具有很强的抗炎作用。EV71进入机体大量复制后,引发机体产生大量的炎症分子,临床上,重症患儿血液中TNF-alpha、IL-6、MCP-1因子剧烈升高,且与HFMD的严重程度密切相关,在乳鼠模型中也得到了证实。本研究中,喜炎平注射液治疗组的TNF-alpha、IL-6、MCP-1分子水平显著降低,表明炎症损伤减轻,这从组织器官中炎症细胞明显减少中也得到了证实。这与穿心莲内酯具有抑制巨噬细胞释放炎性因子功能的研究相一致。TNF-alpha在正常小鼠和人体内含量极微,而在EV71感染动物模型和临床患儿中过量分泌,可能是造成损伤的因素之一。TNF-alpha是体内的内源性致热原,又是造成不可逆休克和死亡的细胞因子,对控制血脑屏障扮演重要角色,血脑屏障打开后,病毒随着血液进入中枢神经系统,必然导致更严重的病理损害,喜炎平注射液的治疗作用可能与此紧密相关。已有的研究表明,IL-6浓度与HFMD患儿感染严重程度正相关,单一的IL-6抗体的治疗作用在HFMD乳鼠模型中也得到了证实。MCP-1是趋化炎性细胞进入局部组织的重要分子之一,过量激活必然导致机体的炎性细胞浸润,导致更严重的组织损伤。喜炎平注射液抑制这些炎症分子的表达,有可能直接发挥减轻组织病理损伤的作用。临床上,HFMD患儿T淋巴细胞减少,而B细胞增加,这与EV71感染乳鼠模型相一致,EV71感染乳鼠中脾淋巴细胞减少,脾脏萎缩,造成机体细胞免疫和体液免疫失衡,整体免疫力下降。本研究中,喜炎平注射液治疗后,无论是T淋巴细胞的比例还是T淋巴细胞的活性均比生理盐水对照明显提高,这与穿心莲内酯可抑制HIV-1所致的淋巴细胞凋亡,上调HIV-1感染者的淋巴细胞CD4+水平一致。B淋巴细胞的活性未有明显改变,说明体液免疫反应未受大的损伤,充分表明穿心莲内酯具有免疫调节活性,但对T和B淋巴细胞的调节并不一致。由于获得性免疫发挥重要的抗病毒作用,所以穿心莲内酯治疗的HFMD乳鼠病毒载量表现出略有降低,可能是获得性免疫发挥作用的结果。临床HFMD患儿和乳鼠动物模型中,中性粒细胞是主要的炎性细胞,虽然至今尚未阐明其在重症HFMD发病中的作用,但猜想与重症HFMD的转归密切相关。中性粒细胞的多少往往决定炎性分子浓度的高低。炎性分子的表达总是与特定的炎性信号通路分子的表达和活性相关,业已证明EV71可显著提高MAPKs的活性和NF-κB的表达水平。本研究中,喜炎平注射液治疗后TNF-alpha、IL-6、MCP-1分子水平显著降低,与中性粒细胞ERK、JNK磷酸化水平降低,NF-κB表达下降直接相关。总之,喜炎平注射液主要通过抗炎和调节免疫提高了EV71感染重症HFMD乳鼠的生存率,为其临床应用提供了可靠的临床前试验依据,而其与其它药物的协同作用以及深入的机制探索正在进行中。导致50%细胞病变的喜炎平注射液质量浓度(50%cellcytotoxitity,CC50)在Vero细胞上测定,即96孔细胞培养板每孔加入104Vero细胞,37℃,5%CO2培养箱中过夜至90%以上单层,加入终质量浓度为2.5~0.025mg/ml的穿心莲内酯磺化物后,放置37℃,5%CO2培养箱中至第5天判定结果;导致50%乳鼠死亡(medianlethaldose,MLD)的喜炎平注射液浓度在7日龄ICR乳鼠上测定,即50~5000mg/(kg·day)的喜炎平注射液腹腔连续注射乳鼠10d,观察至第14天判定结果,使用Karber法计算喜炎平注射液CC50和MLD。1.6治疗措施及量效效应将1.25×107TCID50EV71BJ09/07腹腔注射7日龄ICR乳鼠作为重症HFMD模型。将重症HFMD乳鼠分为喜炎平注射液治疗组和生理盐水对照组,每组8只。第1轮试验,治疗组从感染后第1天、第4天或第7天起开始用药至感染后第10天停药,每天腹腔给予10mg/(kg·day)的喜炎平注射液治疗,而生理盐水对照组以等量生理盐水替代,每天观测乳鼠疾病状态和存活情况至感染后第