羟基丁酸-羟基戊酸共聚物纳米纤维材料修复骨缺损的实验研究

羟基丁酸-羟基戊酸共聚物纳米纤维材料修复骨缺损的实验研究

骨缺损是指因先天性畸形、损伤、感染或肿瘤而造成的缺陷。现在，它通常用于临床治疗中的原料骨、异体骨和人工骨，但无论是人工骨移植、异体骨移植还是人工骨移植都存在一些缺陷。近年来,组织工程原理构建的组织工程化骨(tissueengineeredbone)成为热点,而组织工程中所选择的材料是一个重点。本实验研究羟基丁酸-羟基戊酸共聚物复合羟基磷灰石[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)/hydroxylapatite,PHBV/HA]的纳米纤维材料植入动物体内,观察其生物相容性以及成骨能力,为骨缺损的修复提供一种新型的生物活性材料。1材料和方法1.1实验设计对比分析,动物体内实验。1.2试验单元东南大学附属中大医院骨科,东南大学生物科学与医学工程学院生物电子学国家重点实验室。1.3材料和复合材料新西兰大白兔40只,体重2～2.5kg,雌雄不限(由江苏省农业科学院提供)。PHBV/HA的纳米纤维材料由东南大学生物科学与医学工程学院仿生材料研究室提供(PHBV:PHBPHV,HV12%Sigma公司,美国),通过静电纺丝方法制备直径在600nm左右的PHBV/HA纳米纤维薄膜,然后通过裁剪和折叠最终得到多层棒状三维支架材料。人工骨主要成分硫酸钙(Wrightmedicaltechnology公司,美国)。1.4建立桡骨缺损动物模型用2%戊巴比妥钠30mg·kg-1行兔耳缘静脉麻醉,使用绷带将兔四肢固定在手术台上,右前臂碘伏消毒,铺无菌手术单,无菌条件下于右前肢中段掌侧取弧形切口,切开皮肤及皮下组织,将皮瓣向桡侧牵开,仔细锐性分离桡骨表面肌肉和肌腱组织,注意勿损伤骨膜,向两侧拉开,暴露右侧桡骨中段,以桡骨弧顶为中心(通过桡骨中段两侧桡骨纵轴线的交点确定桡骨弧顶点),用卡尺量出10mm长度(即桡骨弧顶上下各5mm),确定上、下截骨点,于上、下截骨点处用尖刀环形切开骨膜(尽量保证骨膜切缘整齐且两切缘平行),两截骨平面尽量保持平行且避免过度倾斜,建立桡骨缺损动物模型。1.5人工骨材料的选择将动物随机分为3组:实验组在骨缺损处植入PHBV/HA纳米纤维材料,对照组植入人工骨材料,实验组、对照组各随机挑选16只,空白对照组随机挑选8只。生理盐水冲洗伤口后逐层缝合,切口用敷料包扎。术后肌肉注射青霉素钠40万U预防感染,2次·d-1,共3d。1.6骨愈合试验he染色观察术后观察动物饮食、活动,伤口有无肿胀、分泌物等。于4、8、12、16周时行右侧尺桡骨X线摄片检查;处死动物后观察移植材料与宿主骨的连接情况、有无成骨和炎症反应及材料降解情况;观察各组间及同组术后不同时间的骨缺损愈合情况;桡骨标本经10%甲醛溶液固定,常规脱钙、脱水、石蜡包埋、连续切片,切片厚度约为5μm,行HE染色,光镜下观察新骨的生成情况。骨愈合大体观察、组织学观察及X线摄片结果采用Lane-Sandhu法评分标准。扫描电镜观察:取桡骨标本10%甲醛固定,CO2临界点干燥,扫描电子显微镜(ultraplusZERSS公司)观察移植的复合人工骨与宿主骨的界面键合情况、超微结构及新骨的生成情况。生物力学测定:于16周将实验组动物处死后,切取完整桡骨标本在数显式拉压力实验机(Sans-GBT528,深圳,中国)上进行新生骨的极限压缩强度测试,记录最大载荷(maximumloading,即致桡骨断裂时的压力)和挠度(deflection,即最大载荷时的位移)两个力学测试指标。取对侧完整桡骨作对照。1.7统计学处理方法应用SPSS13.0软件包进行分析,数据以x¯±sx¯±s表示,组内比较采用方差分析,组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1缺损区的移植材料的降解术后动物进食及活动正常,切口无红肿、渗液等炎症反应,且如期愈合。术后大体标本均未见炎症反应及异常增生组织。术后4～8周,实验组缺损区内移植材料仍然可见,周围有少量纤维组织和血管长入,材料与宿主骨断端有少量新生骨形成,对照组缺损区移植材料已明显降解,宿主骨两侧断端有明显新生骨形成,但是两端未形成连接;术后8～12周,实验组缺损区内移植材料开始降解,材料与宿主骨断端均有明显新骨形成且与宿主骨结合紧密,对照组缺损区移植材料已完全降解,宿主骨两侧断端有明显新生骨形成,但是两侧断端形成骨质封闭而未形成连接;术后12～16周,实验组缺损区内移植材料已大部分降解,材料与宿主骨部分融合,新骨进一步增多,骨缺损断端已形成骨性连接而得到初步修复,对照组缺损区与之前比较未见明显变化(图1)。空白对照组均为骨缺损。2.2术后16周新生骨结构的观察见图2。实验组:术后4周截骨端两端有少量密度较低的骨痂形成,缺损区呈片状云雾状影。术后8周植入材料处有片状密度增强,截骨处有骨痂向缺损区生长,骨皮质不连续,仍有骨性缺损。术后12周骨缺损处有大量新生骨形成,截骨端模糊不清,截骨端与新生骨形成骨性连接,骨缺损范围基本消失但仍留有裂隙,髓腔尚未再通。术后16周新生皮质骨结构清晰,与宿主皮质骨自然连接且密度接近,骨缺损已完全修复。新生骨显示出正常骨干结构,髓腔再通。对照组:术后4周截骨端两端有少量密度较低的骨痂形成,缺损区可见高密度植入物影。术后8周骨缺损处未见植入物影,截骨处有少量新生骨向缺损区生长,骨性缺损存在。术后12周,骨缺损处未见植入物影,截骨处有新生骨向缺损区生长,骨性缺损仍存在。术后16周,截骨端两端有新生皮质骨形成,断端形成骨质封闭,两端未形成连接,髓腔未通。空白对照组:术后各时间点,缺损区均未见骨性愈合。2.3植材料的术后感染情况表现为见图3。实验组:术后4周宿主结缔组织、纤维组织长入植骨材料中心及周边,可见肉芽组织,无明显骨形成,有少量软骨形成,可见少量成骨细胞。术后8周植入材料未见明显吸收,新生软骨连接成片,可见成骨细胞,并有较多编织骨形成。术后12周植入材料部分吸收,可见板状骨和多处骨单位的形成,有少量骨髓组织产生。术后16周植入材料有少量残余,大量板状新生骨形成,骨单位的排列和结构与正常皮质骨切片无明显异常,可见大量骨髓组织形成。对照组:术后4周植入材料部分降解,宿主骨与材料连接处可见少量新生骨形成。术后8周植入材料少量残余,宿主骨断端处有较多编织骨和少量板层骨形成。术后12周未见明显植入材料,宿主骨断端处有大量新生板层骨,可见多处骨单位。术后16周未见明显植入材料,宿主骨断端处有大量新生板层骨,骨单位的排列与结构同正常皮质骨切片无明显异常,未见骨髓组织。2.4根据lane-sandhu法对骨缺损的修复进行评估影像学评分见表1,组织学评分见表2。2.5材料残留和材料降解实验组术后4周材料未见明显降解,材料表面可见部分钙化组织;术后16周材料植入处未见明显材料残留,新生骨中可见骨皮质中有较多的骨单位和髓腔形成。对照组术后4周可见材料部分降解,材料表面有钙盐沉积;术后16周可见截骨端有较多新生骨质生成,但未见髓腔形成。见图4。2.6生物力学测试分别对16周取出的实验组桡骨标本和正常桡骨标本进行压缩试验,结果见表3。3phbv复合材料的植入目前临床上修复骨缺损的方法有多种多样,如人工骨、异体骨、自体骨等,本次实验中我们选取目前临床上较为常用的硫酸钙人工骨作为对照组,硫酸钙人工骨具有良好的骨传导功能、生物相容性及生物降解性,在临床上的使用已经体现了良好的修复骨缺损的作用,但是其需要在骨或骨膜的存在下才能发挥促进骨质再生的作用,并且在骨质缺损较大的情况下必须结合自体骨植入来发挥作用。通过此次实验可发现,硫酸钙人工骨植入桡骨缺损后只能有限地修复缺损,使截骨两端未能形成连接,或仅仅有皮质骨的连接,未形成相通的髓腔。PHBV材料具有良好的压电性、生物相容性、生物降解性等性质,其在体外可以促进细胞的黏附、增殖及分化,体内可以促进组织的再生,但随着近年来研究的深入,PHBV材料亦表现出其不足,未经任何处理的材料难以使细胞附着、增殖、分裂。单纯的PHBV材料在体外的细胞培养应用中未能发现明显的矿化作用,植入小鼠胫骨缺损处的PHBV材料对刺激骨质增生并无明显作用,细胞并未长入材料内部。目前,主要的办法是将PHBV材料与其他材料做成复合材料。HA有良好的生物活性和骨传导作用,在与PHBV材料混合后能达到非常好的骨组织重建作用。Coskun等发现,将PHBV材料上复合15%的HA材料后具有促进细胞增殖的作用。Cool等通过实验发现复合TCP(三磷酸钙)或HA材料的PHBV材料比单纯的PHBV材料有更少的炎症反应,有更好的成骨细胞黏附、增殖作用,其中PHBV复合HA材料更具优势。本次实验中我们采用PHBV复合HA的纳米纤维材料进行兔桡骨缺损的植入修复,实验中发现,8周之前实验组与对照组在修复骨缺损方面的作用相差不多,在新生骨的生成及材料上的生物矿化能力方面无显著差异,而8周之后,特别是到12周时实验组体现了更好的成骨能力,截骨两侧断端随着新生骨的生成而连接,16周时实验组的大部分均已出现髓腔相通和骨干塑形的表现,而对照组并未能发现对骨缺损的进一步修复,在后期也未发现髓腔相通。通过PHBV复合HA的纳米纤维材料修复缺损的兔桡骨在16周取出进行生物力学测试时,与正常桡骨相比未见显著差异。在生物相容性及毒性方面,两组材料植入后手术切口均愈合良好,大体标本及组织切片均未发现明显炎症反应。另一方面,可明显看到硫酸钙人工骨的降解速度快于PHBV复合HA的纳米纤维材料,8周时硫酸钙基本已降解,而PHBV复合HA的纳米纤维材料在12周后仍有小部分残留。从材料的降解性能方面来解释两组材料成果的差异,我们认为硫酸钙不能完全修复骨缺损的原因可能在于其降解速度快于两侧断端骨组织的爬行速度。PHBV复合HA的纳米纤维材料的降解速度适宜于骨组织向缺损