锁阳多糖超声提取工艺优化及其含量测定

锁阳多糖超声提取工艺优化及其含量测定

锁阳，俗称“老药”，也被称为羊咬不拉。这是锁阳科多年生寄生草本植物的锁阳。它通常生长在小麦科的白刺科上。现代药理学研究证明,锁阳多糖具有延缓衰老、抗疲劳、提高机体免疫力、抗应激及抗糖尿病等作用。锁阳的保健价值已被广泛重视,出现了锁阳咖啡、锁阳糖、锁阳冲剂等以锁阳多糖为主要原料的食品、保健品、礼品及药品等,具有很大的开发潜力。本实验采用单因素及正交实验法对超声辅助提取锁阳多糖的工艺进行优化,并对不同来源锁阳样品中多糖含量进行测定,为锁阳多糖的提取、含量测定以及质量标准的制定提供科学依据。1材料和方法1.1超纯水的制备锁阳瓜州亿得生物科技有限公司提供,产地为甘肃省瓜州县,经鉴定为锁阳科锁阳属植物锁阳(CynomoriumsongaricumRupr.)的肉质茎,样品于50℃干燥恒重,粉碎,过100目筛,密封保存备用。葡萄糖天津致远;苯酚天津富宇;浓硫酸白银银环;石油醚天津富宇等均为分析纯;实验用水为超纯水由纯水仪制得。KQ-600DE型数控超声波清洗仪昆山市超声仪器有限公司;AB104-N电子天平Mettle-Toledo公司;CARY50ProbeUV-VisiblespectrophotometerVARIANAustraliaRTYLTD;Exceed-Da-20型艾柯纯水仪成都康宁实验纯水仪器厂。1.2实验方法1.2.1样品溶液中葡萄糖含量的测定1.2.1.提取与除蛋白质称取干燥的锁阳粉末100g,石油醚脱脂2次/1h,药渣挥干溶剂后,80%乙醇回流提取2次/2h,药渣挥干溶剂,加蒸馏水水浴回流提取3次/2h。过滤,合并3次提取液,浓缩至200mL左右,加0.1%活性炭,80℃水浴1h脱色,放冷后过滤。滤液中加95%乙醇,使含醇量达80%,静置过夜,离心后将沉淀用蒸馏水溶解,按Sevag法(氯仿-正丁醇(4∶1))除蛋白质。再将水液反复醇沉3次,离心后取沉淀,以无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤,干燥后即得锁阳粗多糖。1.2.1.葡萄糖对照溶液精密称取105℃干燥至恒重的标准葡萄糖25mg,置250mL容量瓶中,加蒸馏水溶解并定容至刻度,得0.1mg/mL的葡萄糖对照溶液。1.2.1.3.试溶液的制备精密称取锁阳粗多糖100mg,加水溶解并定容至50mL,得供试品溶液备用。1.2.1.%苯酚法精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1.0mL于具塞试管中,加蒸馏水1.0mL。另取2.0mL蒸馏水作为空白。每一试管中加入1.0mL5%苯酚溶液,混匀,迅速加入5.0mL浓硫酸,摇匀,放置10min,置40℃水浴保温15min,取出后迅速冷却至室温。于400~700nm波长范围内进行扫描,结果表明葡萄糖对照品与锁阳多糖在490nm处均有特征吸收,故选490nm作为测定波长。1.2.1.加蒸馏时间的确定精密移取葡萄糖对照液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL,依次加蒸馏水使最终体积为2.0mL,另取2.0mL蒸馏水作为空白。同“测定波长的选择”项下方法操作,于490nm处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标,葡萄糖浓度为横坐标绘制曲线。1.2.1.锁阳多糖得率的测定精密称取锁阳样品粉末1.0000g,6倍体积石油醚回流脱脂2次/2h,药渣挥干石油醚后,以6倍体积80%乙醇回流提取2次/2h。药渣挥干溶剂后以蒸馏水为提取溶剂,按不同的超声功率、料液比、提取温度、超声提取时间、提取次数制得锁阳多糖提取液,冷却后,加水定容于100mL容量瓶中,摇匀,得锁阳供试品溶液。稀释至合适浓度后吸取2.0mL于具塞试管中,按“标准曲线的绘制”项下操作,测定供试品溶液的吸光度值,并按下式计算多糖得率。式中:C为供试液中葡萄糖浓度(mg/mL);V为稀释后供试液总体积(mL);m为供试品重量(mg)。1.2.2单因素研究选择超声功率、料液比、提取温度、超声提取时间及提取次数为因素,考察各因素对锁阳多糖得率的影响。1.2.2.超声功率对锁阳多糖得率的影响精密称取锁阳粉末1.0000g,超声功率分别设定为240、360、480、600W(不同超声功率做3个平行),以料液比1∶30,提取温度80℃,超声时间70min,提取2次,考察超声功率对锁阳多糖得率的影响。1.2.2.料液比对锁阳多糖得率的影响精密称取锁阳粉末1.0000g,在以上因素筛选结果的基础上,料液比分别设定为1∶6、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(不同料液比做3个平行),提取温度80℃,提取时间70min,提取2次,考察料液比对锁阳多糖得率的影响。1.2.2.提取温度对锁阳多糖得率的影响试验精密称取锁阳粉末1.0000g,在以上因素筛选结果的基础上,提取温度分别设为60、70、80、90℃(不同温度做3个平行),提取时间70min,提取2次,考察提取温度对锁阳多糖得率的影响。1.2.2.超声提取时间对锁阳多糖得率的影响精密称取锁阳粉末1.0000g,在以上因素筛选结果的基础上,提取时间分别设定为30、50、70、90min(不同时间做3个平行),提取2次,考察超声提取时间对锁阳多糖得率的影响。1.2.2.提取次数对锁阳多糖得率的影响精密称取锁阳粉末1.0000g,在以上因素筛选结果的基础上,提取次数分别设定为1、2、3、4次(不同提取次数做3个平行),考察提取次数对锁阳多糖得率的影响。1.2.3锁阳中多糖提取工艺的正交实验综合单因素实验结果,设计4因素3水平(L9(34))正交实验对锁阳中多糖超声提取工艺进行优化,并利用SPSS软件对实验数据进行方差分析。实验设计中的因素水平表见表1。1.2.4方法研究1.2.4.1.精细试验精密吸取一定量对照品溶液,按“标准曲线的绘制”项下方法测定其吸光度,连续测定6次。1.2.4.2重复试验1.2.4.对照品溶液和样品溶液吸收剂用量的测定精密吸取在放置0、2、4、6、8h后的对照品溶液和样品溶液各1.0mL置具塞试管中,按“标准曲线的绘制”项下操作,测定其吸光度。1.2.4.加样回收率及rsd值的测定精密称取9份同一批已知含量的锁阳样品,分别精密加入一定量的对照品,同时制取9份提取液,按“标准曲线的绘制”的方法测其吸光度值,计算回收率及RSD值。1.2.5锁阳供试品溶液的制备精密称取各批次锁阳粉末1.0000g置于100mL圆底烧瓶中,按照最优工艺,制得的锁阳提取液,冷却后,加水定容于100mL容量瓶中,摇匀,得锁阳供试品溶液。稀释至合适浓度后吸取2.0mL于具塞试管中,按“标准曲线的绘制”项下的操作,测定供试品溶液的吸光度,按得率公式计算样品中多糖含量。2结果与分析2.1葡萄糖溶液线性范围根据“标准曲线的绘制”项下方法,测得回归曲线方程:Y=12.6308X-0.0144(r=0.9997),表明葡萄糖溶液在0.01~0.09mg/mL浓度范围内,线性关系良好(实验数据如图1所示)。2.2单因素研究和结果2.2.1超声功率对多糖得率的影响实验结果如图2所示,超声功率从240W增大到480W时,多糖得率随之增大,并在480W时达最大值,当超声功率继续增大,得率下降,故选择超声功率为480W。2.2.2不同时间点多糖得率实验结果如图3所示,料液比从1∶6增加到1∶30的过程中,多糖得率逐渐增大,至1∶30时达最大值。随后继续增大料液比,得率下降,故选择提取料液比为1∶30。2.2.3提取温度对多糖得率的影响实验结果如图4所示,温度从60℃升高到80℃过程中,多糖得率随提取温度的升高逐渐增大,80℃时达最大值。而后随温度继续增大,得率下降,故选定提取温度为80℃。2.2.4超声提取时间对多糖得率的影响实验结果如图5所示,超声提取时间从30min增加至70min的过程中,多糖得率逐渐增大,且在70min时达最大值,而后减小,故选择超声提取时间为70min。2.2.5提取时间对得率的影响实验结果如图6所示,提取次数从1次到2次,得率增大幅度较明显,再增加提取次数,得率没有明显的提高,故选定提取次数为2次。2.3锁阳多糖得率正交实验设计在单因素筛选结果基础上,为进一步考察各因素之间的相互影响,选择超声功率(A)、料液比(B)、提取温度(C)和超声提取时间(D)为考察因素,以多糖得率为评价指标,设计了4因素3水平(L9(34))正交实验。正交实验结果见表2;方差分析结果见表3。正交实验数据显示,各因素对锁阳多糖得率影响次序为:提取温度>超声功率>料液比>超声时间。得到最佳条件为A1B3C2D1,即超声功率为420W,料液比为1∶35,提取温度为80℃,提取时间为60min。2.4最佳配方的验证按正交实验确定的最佳提取条件并在提取2次情况下,测得多糖含量为4.51%(n=5,RSD=1.98%),比正交实验结果中的较优组4.37%得率高,表明此正交实验得出的最优组合准确可行。2.5研究方法的结果2.5.1精密度实验结果如表4所示,6次连续测定吸光度值的RSD=0.10%,表明仪器精密度良好,测定结果可靠。2.5.2重复实验实验结果如表5所示,多糖含量的相对标准偏差RSD=1.98%,表明本方法重复性良好。2.5.3稳定实验2.5.4相对标准偏差实验结果如表7所示,加样回收率在95.81%~104.20%之间,相对标准偏差RSD=3.03%(n=9),表明该方法简便、快速、准确,灵敏度高,可用于锁阳多糖的含量测定。2.6瓜州锁阳多糖含量的变化根据正交实验得出的最佳提取工艺,提取并测定不同来源的锁阳样品多糖含量,结果如表8:实验结果显示,瓜州锁阳除2009年5月采摘的002号样外,其余样品的多糖含量明显高于内蒙和新疆样品,这可能与其当年的生长环境的土壤营养、水分、气候等因素有关。瓜州锁阳中,又以三九锁阳多糖含量最高;不同生产年限锁阳中,多糖含量也有一定的差异。3超声提取锁阳多糖的最佳条件近年来,使用超声提取锁阳多糖的研究较少,且均未对超声功率进行筛选研究。本研究结果表明,超声功率对锁阳多糖得率影响显著,并且得到的超声提取工艺能明显提高锁阳多糖的得率。本研究通过单因素及正交实验的系统筛选研究结果表明,各影响因素中,提取温度和超声功率对锁阳总多糖得率影响显著,而料液比和超声时间的影响较小。得到超声提取锁阳多糖的最佳条件为:超声功率为420W,料液比为1∶35,提取温度为80℃,提取时间为60min。且通过精密度、重复性、稳定性和加样回收率实验结果表明此方法操作简便、灵敏度高,适合锁阳样品中多糖含量的测定。对不同来源锁阳样品中多糖含量测定结果表明,瓜州锁阳样品中多糖含量较新疆和内蒙两地的高,而瓜州样品中又以三九锁阳多糖含量最高,这与“瓜州锁阳甲天下”和